産品儲存：

4℃保存，有(yǒu)效期 12 個(gè)月。

1、制(zhì)品說明(míng)：

Protein A 4FF 蛋白純化試劑盒是一款能夠高(gāo)效完成免沉澱(IP)及免共沉澱 CO-P 實驗的試劑 盒其包含高(gāo)性能 ProteirA/G Magoly Beads，能夠實現快速便捷的磁性分離。另外試劑盒 內(nèi)經過優化的援沖液，為(wèi)免疫沉澱實驗提供了良好的反應條件，增強了免疫沉澱實驗的穩 定性聚合物磁珠的配體(tǐ)是重組蛋白 A/G(約 14kDa ，同時(shí)擁有(yǒu)蛋自 A 和(hé)蛋白 G 的 gG 結合 結構域，具有(yǒu)更廣的抗體(tǐ)亞型結合範圍。試劑盒的洗脫方式多(duō)樣，既可(kě)以用低(dī) PH 的洗脫液  将免應合物從蛋白 A/G 磁珠上(shàng)洗脫，也可(kě)以使用電(diàn)泳上(shàng)樣組沖液以變性條件洗脫免疫複合 物，直接進行(xíng)後續檢測分析。

本産品可(kě)廣泛應用于細胞裂解物、細胞分泌上(shàng)清、血清、腹水(shuǐ)等樣品中抗原的免疫沉澱反 應。

 2、操作(zuò)步驟：

 2.1 緩沖液的準備

 可(kě)使用試劑盒準備的緩沖液，也可(kě)根據實際情況 配制(zhì)不同的級沖液體(tǐ)系。kemix/Wh  Buffe5x)在使用前請(qǐng)釋至并标記為(wèi) 1xkemix /MashEuffer,另根據需求,補加終汰度為(wèi)

0.1%-1% 的 Lysis/Wash Buffer Enhanced,标記為(wèi) 1xLysis/Wash Bufe(Enhanced) 所有(yǒu)緩 沖液在使用前建議用 0.22 pm 或者 0.45 m 膜過釋後的液建議 4C 保存,若試劑渾濁請(qǐng)立即 丢棄.

下列可(kě)能用到的試劑及材料未提供，需額外準備:

1)電(diàn)泳上(shàng)樣緩沖液,非還(hái)原性(5x): 0.3 MTsC,pH 6.8,5% SDS,50% 甘油,0.5% 澳酚藍(lán) 2)二硫蘇糖醇(DTTT

3) 蛋白酶抑制(zhì)劑

4)免疫沉澱所用抗原、抗體(tǐ)

2.2 樣品準備

方案 I; 貼壁細胞的裂解

1)小(xiǎo)心去除單層細胞的培養基

2)用預冷 PBS 清洗細胞兩次

3)根據表 2 的推薦體(tǐ)積向細胞中加入預冷的 Wash BuferEnhanced)冰上(shàng)育 5 min, 期問混勻幾次。

4)将上(shàng)述裂解好的樣品轉移至一個(gè)新的離心管中,約 13000xg 離心 10 min,分離細胞碎片 5 将上(shàng)清轉移到一個(gè)新管中，進行(xíng)蛋白濃度測定及後續實驗，标記為(wèi)細胞裂解樣品。

針對各種培養皿的 1x MashEuffer(Enhanced)的推薦使用體(tǐ)積

方案 II:懸浮培養細胞的裂解

1)将細胞懸液以 1000xg 離心 5min,收集細胞，棄上(shàng)滿

2)用預冷 FBS 将細胞團輕輕重，細胞縣液以 1000xg 離心 5mn,收集細胞棄上(shàng)清

3)向細脂團塊中加入預冷 1xLysisWashBuffer (Enhanced)每 50mg 細圈團塊便用 500L。

4)将上(shàng)述要好的樣品在冰上(shàng)育 5mn,期間(jiān)濕勻幾次 13000xg 離心 10min,去除細胞碎片。 

5)将上(shàng)清轉移到一個(gè)新管中,備蛋白濃度測定及後續實驗，标記為(wèi)細胞裂解樣品.

2.3 免疫沉澱

抗原、抗體(tǐ)與磁珠的結合順序可(kě)根據實際情況調整,不同的孵育順序對最終純度及抗原産量 均有(yǒu)影(yǐng)響,以下方案為(wèi)推薦常用的實驗方法。

2.3.1 磁珠  洗

1) 将 ProteinA/G MagPoly Beads 充分混勻，取 20uL(0.2mg)加入 1.5mL 離心管中.

2) 向磁珠中加入 180uL 1x WashBuffer (Enhanced)輕微渦旋混勻。 3) 将離心管置于磁分離器(qì)上(shàng)，待磁珠全部吸附後，吸棄上(shàng)清。

4) 向離心管中加入 1 ml Wash Buffer (Enhanced),颠倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混 1min 将離心管置于磁分離上(shàng)，特強珠全部吸附後,吸棄上(shàng)清。

2.3.2 免疫沉澱

方案 I

1) 向上(shàng)述準備好的磁珠(步驟 2.3.1)中加入抗體(tǐ),抗體(tǐ)推薦用量 2-10ug，用抗體(tǐ)保存液 或 1x Wash Bufer 補充體(tǐ)積至 500 uL，室溫混旋孵育 30 min,将離心管置于磁分 離器(qì)上(shàng),待磁珠全部吸附後,吸取上(shàng)清,留樣用于檢測。

注:育溫度和(hé)時(shí)間(jiān)範圍推薦為(wèi):室溫、30 min-2h,或者 4℃ 1h-16h,根據實際的結合效果進 行(xíng)調整。

2)向離心管中加入 500uL 1x Wash Bufer,颠倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻 1 min, 将離心管置于磁分離器(qì)上(shàng),待磁珠全部吸附後,吸棄上(shàng)清,重複至少(shǎo)兩次。

3)向離心管中加入 500uL 細胞裂解樣品(步驟 2.2）,每個(gè)免沉澱反應推薦的總蛋白量為(wèi)  500-1000ug :體(tǐ)積不足 500UL 可(kě)用 1x Wash Bufer (Enhanced)補足,室溫混旋孵育 30min,将離心管置于磁分離器(qì)上(shàng),特磁珠全部吸附後,吸取上(shàng)清,樣用于檢測。

注:孵育溫度和(hé)時(shí)間(jiān)範圍推薦為(wèi):室溫 30 minh,或者 4℃ 1h-16h,根據實際的結合效果進行(xíng) 調整。

方案 II

1) 在離心管中,将細胞裂解樣品(步驟 2.2)與抗體(tǐ)混合孵育 30 min。

推薦抗體(tǐ)用量為(wèi) 2-10ug,每個(gè)免疫沉澱反應薦的胞裂解液總蛋白量為(wèi) 500-1000ug，體(tǐ)積不 足建議用 1x Wash Bufer (Enhanced)将樣品體(tǐ)積調整至 500uL。

2) 将孵育後的樣品加入準備好的磁珠(步驟 2.3.1)中混旋孵育。

注:孵育溫度和(hé)時(shí)間(jiān)範圍推薦為(wèi):室溫 30 minh,或者 4℃ 1h-16h,根據實際的結合效果進行(xíng) 調整。

3) 将離心管置于磁分離器(qì)上(shàng)，待磁珠全部吸附後,吸取上(shàng)清，留樣用于檢測。

2.3.3 磁珠漂洗

1)向離心管中加入 500uL  1x Wash Bufer (Enhanced),颠倒離心管數(shù)次或輕微渦旋 混勻 1 min,将離心管置于分離器(qì)上(shàng),待磁珠全部吸附後，吸附上(shàng)清，重複一次。

2)向離心管中加入 500uL 1x Wash Bufer (Enhanced)，連同磁珠轉移至一個(gè) 新 EP 管 中,颠倒離心管數(shù)次或輕微渦旋混勻 1min,将離心管置于磁分離器(qì)上(shàng),待磁珠全部吸附後，

吸棄上(shàng)清。

2.3.4 洗脫

方案 I 低(dī)pH 洗脫

向離心管中加入 50uL IP Elution Buffer,室溫混旋孵育 10 min,将離心管置于磁分離器(qì) 上(shàng),待磁珠全部吸附後,吸取上(shàng)清為(wèi)洗脫液加入 5-10 L Neutralization Buffer。

方案 II 備選洗脫方法(變性洗脫)

向離心管中加入 50uL(1x)電(diàn)泳上(shàng)樣緩沖液,将樣品置于金屬浴中，96-100℃加熱 10 min。 通(tōng)過磁分離器(qì)分離磁珠,保留含有(yǒu)目的抗原的上(shàng)樣緩沖液。

注:兩種洗脫方案均包含捕獲抗體(tǐ)及目的抗原,低(dī) pH 洗脫樣本中抗體(tǐ)為(wèi)完整結構,變性洗脫樣本中抗體(tǐ)解離為(wèi)重鏈、輕鏈,請(qǐng)根據後續實驗需求選擇洗脫方案。

注意事項：

1)在進行(xíng)免疫沉澱操作(zuò)之前,請(qǐng)務必認真閱讀此說明(míng)書(shū)

2) 除非另有(yǒu)說明(míng),所有(yǒu)操作(zuò)建議于 8℃下進行(xíng)。

3)在保證洗雜效果的前提下,如果使用 1x Wash Buffer (Enhanced) 洗雜,會(huì)造成抗 體(tǐ)和(hé)介質,或者抗原和(hé)抗體(tǐ)之間(jiān)結合效果降低(dī),建議可(kě)以使用 1x Wash Buffer 進行(xíng) 洗雜。

4)磁珠應保存在儲存溶液中，防止幹燥，使用前請(qǐng)充分混勻。

5) 如果需要在還(hái)原條件下洗脫,向 1x 電(diàn)泳上(shàng)樣緩沖液中加入 DTT(終濃度 10-20 mM)。 6)經煮沸後的填料易聚集并且失去抗體(tǐ)結合能力,經煮沸的填料不應再次使用。

7)為(wèi)保證最佳的實驗結果，請(qǐng)選擇特異性較強的抗體(tǐ)進行(xíng)免疫沉澱反應。

8)對于免疫沉澱實驗，若本試劑盒提供的緩沖體(tǐ)系不能獲得(de)很(hěn)好的實驗結果,可(kě)自行(xíng)優化緩 沖液進行(xíng)實驗。

9) 實驗設計(jì)時(shí)，建議加入對照組，以備後續實驗結果分析。

10)在确定實驗結果前,建議保留各步驟抗原、抗體(tǐ)孵育後的樣品以備驗證。