1. 産品組分
組分
Super Fusion Cloning Mix (2×)
pUC19 Control Plasmid, linearized (Ampr,40ng/μL)
500 bp Control Fragment (20 ng/μL)
注： -20℃保存，兩年有(yǒu)效。微量體(tǐ)積試劑請(qǐng)在正式實驗開(kāi)始前進行(xíng)瞬時(shí)離心操作(zuò)。
2. 産品介紹
基于重組原理(lǐ)的無縫克隆技(jì)術(shù)，作(zuò)為(wèi)新一代的克隆方法，不依賴繁瑣的酶切、同源序列的重組，可(kě)将插入片段克隆 至任意線性載體(tǐ)的任意位點連接步驟，也不需要末端補平等操作(zuò)，依據 DNA 片段 與線性化載體(tǐ)末端的 15~25 nt，載體(tǐ)自連背景極低(dī)，是一種簡單、快速、高(gāo)效的 DNA 定向克隆技(jì)術(shù)以上(shàng)。一次反應可(kě)完成單至多(duō)個(gè)重組，最快僅需 5 分鍾即可(kě)完成單片段重組，且陽性率高(gāo)于 95%。Mix 中添加的輔助因子，有(yǒu)效提高(gāo)克隆 陽性率；經優化的反應體(tǐ)系，能夠一定程度上(shàng)耐受未純化 PCR 産物 中含有(yǒu)的雜質。
3. 使用方法
一． 制(zhì)備線性化克隆載體(tǐ)
選擇合适的克隆位點，對載體(tǐ)進行(xíng)線性化，線性化載體(tǐ)可(kě)以通(tōng)過酶切或者反向 PCR 擴增完成。
（1） 酶切制(zhì)備
雙酶切：線性化完全，轉化背景（假陽性克隆）低(dī)；
單酶切：線性化程度差，可(kě)通(tōng)過适當延長酶切時(shí)間(jiān)來(lái)減少(shǎo)環狀質粒的殘留。
注 1：雙酶切無需去磷酸化，單酶切需要去磷酸化；
注 2：酶切完成後，應将快速內(nèi)切酶失活或對目的産物純化後再用于重組反應。
（2）反向 PCR 擴增制(zhì)備
載體(tǐ)質粒 DNA 為(wèi)模闆，克隆位點為(wèi)分界點，設計(jì)一對反向引物，推薦使用高(gāo)保真 PCR Mix 進行(xíng)擴增。
二． 設計(jì)插入 PCR 引物片段
PCR 引物的 5’端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體(tǐ)）末端同源的 15~25 nt（推薦 18 nt）序列。假如載體(tǐ)為(wèi)粘性末端，且 3’端突出，則引物設計(jì)必須包含突出部分；若 5’端突出，則引物設計(jì)可(kě)以包含突出部分，也可(kě)以不包含。
插入片段正向擴增引物：
5’—上(shàng)遊載體(tǐ)末端同源序列+酶切位點（可(kě)選）+基因特異性正向擴增序列—3’
插入片段反向擴增引物：
3’—基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可(kě)選）+下遊載體(tǐ)末端同源序列—5’
注：盡量選擇無重複序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進行(xíng)克隆，當載體(tǐ)克隆位點上(shàng)下遊 25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為(wèi)
40~60%時(shí)，重組效率最高(gāo)
三． 插入片段的 PCR 擴增
推薦使用高(gāo)保真 PCR Mix 進行(xíng)擴增，以減少(shǎo)擴增突變的引入。建 議使用純化後的 PCR 産物進行(xíng)無縫克隆反應，若 PCR 産物經瓊脂糖 凝膠電(diàn)泳鑒定為(wèi)特異性擴增産物，可(kě)直接使用，但(dàn)加樣體(tǐ)積不應超過 總反應體(tǐ)積的 20%。
四． 無縫克隆反應
1. 冰水(shuǐ)浴中配制(zhì)以下反應體(tǐ)系：
a. 适載體(tǐ)用量（ng）= 0.02×載體(tǐ)堿基對數(shù)，即 0.03 pmol。
b. 插入單片段時(shí)，最适片段用量（ng）=0.04×片段堿基對數(shù)；插入多(duō)片段時(shí)，每片段最适用量 （ng）= 0.02×片段堿基對數(shù)。
注 1：如果插入的單片段長度大(dà)于載體(tǐ)，那(nà)麽應互換載體(tǐ)與插入片段用量；
注 2：如果插入的片段長度小(xiǎo)于 200 bp，那(nà)麽要使用 5 倍載體(tǐ)的用量；
注 3：如果按上(shàng)述公式計(jì)算(suàn)得(de)到的用量低(dī)于最低(dī)/高(gāo)于最高(gāo)值，那(nà)麽建 議直接按最低(dī)/最高(gāo)用量 使用
注 4：載體(tǐ)或插入片段過長，片段數(shù)量過多(duō)，均會(huì)降低(dī)陽性率。
重組反應體(tǐ)系配制(zhì)完成後，輕輕吹吸數(shù)次混勻各組分，避免産生(shēng)氣泡即可(kě)，切勿渦旋。
2. 将反應體(tǐ)系置于 50℃，反應 5-60 min。
注 1：推薦使用溫控比較精準的儀器(qì)進行(xíng)反應，如 PCR 儀，反應時(shí)間(jiān)不足或過長都會(huì)降 低(dī)克隆效率；
注 2：插入 1~2 個(gè)片段時(shí)，推薦反應時(shí)間(jiān)為(wèi) 5~15 min；插入 3~5 個(gè)片段時(shí)，推薦反 應 時(shí)間(jiān)為(wèi) 15~30 min；
注 3：當載體(tǐ)骨架在 10 kb 以上(shàng)或插入片段在 4 kb 以上(shàng)時(shí)，建議延長反應時(shí)間(jiān)到 30~60 min；
注 4：50℃反應完成後，建議進行(xíng)瞬時(shí)離心，将反應液收集至管底。
3. 将反應液離心管置于冰水(shuǐ)浴中冷卻，直接進行(xíng)轉化或儲存于-20℃。
注：-20℃儲存的重組産物，建議在 1 周內(nèi)使用。
五． 克隆産物轉化
在 100 μL 感受态細胞中加入 5-10 μL 反應液，輕柔吹吸混勻，置于冰上(shàng) 30min。42℃熱激 45~60s，冰浴 5 min。加入 500 μL SOC 或 LB 培養基，37℃振蕩培養 40-60 min（200 rpm）。将菌液均勻塗布在含相應抗生(shēng)素的平闆上(shàng)，倒置于37℃培養箱培養過夜。
注 1：不同感受态細胞最後的克隆陽性率會(huì)有(yǒu)所差别，推薦使用轉化效率>10 8 cfu/μg 的感受 态細胞；
注 2：PCR 産物與線性化載體(tǐ)的數(shù)量和(hé)純度決定了菌落數(shù)；
注 3：陽性對照平闆通(tōng)常生(shēng)長大(dà)量白色單菌落，陰性對照平闆隻生(shēng)長很(hěn)少(shǎo)的菌落。
六． 陽性克隆檢測
菌落 PCR 鑒定：挑取單菌落置于 10 μL ddH2O 中混勻，95℃裂解 10 min，取1 μL作(zuò)模闆，進行(xíng)菌落 PCR 鑒定。
酶切鑒定：将單菌落接種到抗性培養基中培養過夜，提取質粒進行(xíng)酶切鑒定。
注 1：建議菌落 PCR 時(shí)，至少(shǎo)使用一條通(tōng)用引物，可(kě)有(yǒu)效避免假陽性結果；
注 2: 必要時(shí)可(kě)進一步對陽性結果進行(xíng)測序鑒定
