Fusion -高(gāo)效同源重組預混液(多(duō)片段)
KF0901-50
50T
-20℃
規格 價格
50T ¥1200

1. 産品組分

組分                                      

Super Fusion Cloning Mix (2×)

pUC19 Control Plasmid, linearized

500 bp Control Fragment 

注: -20保存,兩年有(yǒu)效。微量體(tǐ)積試劑請(qǐng)在正式實驗開(kāi)始前進行(xíng)瞬時(shí)離心操作(zuò)。

2. 産品介紹

基于重組原理(lǐ)的無縫克隆技(jì)術(shù),作(zuò)為(wèi)新一代的克隆方法,不依賴繁瑣的酶切、同源序列的重組,可(kě)将插入片段克隆 至任意線性載體(tǐ)的任意位點連接步驟,也不需要末端補平等操作(zuò),依據 DNA 片段 與線性化載體(tǐ)末端的 15~25 nt,載體(tǐ)自連背景極低(dī),是一種簡單、快速、高(gāo)效的 DNA 定向克隆技(jì)術(shù)以上(shàng)。一次反應可(kě)完成單至多(duō)個(gè)重組,最快僅需 5 分鍾即可(kě)完成單片段重組,且陽性率高(gāo)于 95%。Mix 中添加的輔助因子,有(yǒu)效提高(gāo)克隆 陽性率;經優化的反應體(tǐ)系,能夠一定程度上(shàng)耐受未純化 PCR 産物 中含有(yǒu)的雜質。

3. 使用方法

一. 制(zhì)備線性化克隆載體(tǐ)

選擇合适的克隆位點,對載體(tǐ)進行(xíng)線性化,線性化載體(tǐ)可(kě)以通(tōng)過酶切或者反向 PCR 擴增完成。

(1) 酶切制(zhì)備

雙酶切:線性化完全,轉化背景(假陽性克隆)低(dī);

單酶切:線性化程度差,可(kě)通(tōng)過适當延長酶切時(shí)間(jiān)來(lái)減少(shǎo)環狀質粒的殘留。

注 1:雙酶切無需去磷酸化,單酶切需要去磷酸化;

注 2:酶切完成後,應将快速內(nèi)切酶失活或對目的産物純化後再用于重組反應。

2)反向 PCR 擴增制(zhì)備

載體(tǐ)質粒 DNA 為(wèi)模闆,克隆位點為(wèi)分界點,設計(jì)一對反向引物,推薦使用高(gāo)保真 PCR Mix 進行(xíng)擴增。

二. 設計(jì)插入 PCR 引物片段

PCR 引物的 5’端必須包含與其相鄰片段(插入片段或載體(tǐ))末端同源的 15~25 nt(推薦 18 nt)序列。假如載體(tǐ)為(wèi)粘性末端,且 3’端突出,則引物設計(jì)必須包含突出部分;若 5’端突出,則引物設計(jì)可(kě)以包含突出部分,也可(kě)以不包含。

插入片段正向擴增引物:

5’—上(shàng)遊載體(tǐ)末端同源序列+酶切位點(可(kě)選)+基因特異性正向擴增序列—3

插入片段反向擴增引物:

3’—基因特異性反向擴增序列+酶切位點(可(kě)選)+下遊載體(tǐ)末端同源序列—5’

注:盡量選擇無重複序列且 GC 含量均勻的區(qū)域進行(xíng)克隆,當載體(tǐ)克隆位點上(shàng)下遊 25 nt 區(qū)域內(nèi) GC 含量為(wèi)

40~60%時(shí),重組效率最高(gāo)

三. 插入片段的 PCR 擴增

推薦使用高(gāo)保真 PCR Mix 進行(xíng)擴增,以減少(shǎo)擴增突變的引入。建 議使用純化後的 PCR 産物進行(xíng)無縫克隆反應,若 PCR 産物經瓊脂糖 凝膠電(diàn)泳鑒定為(wèi)特異性擴增産物,可(kě)直接使用,但(dàn)加樣體(tǐ)積不應超過 總反應體(tǐ)積的 20%。

四. 無縫克隆反應

1. 冰水(shuǐ)浴中配制(zhì)以下反應體(tǐ)系:

a. 适載體(tǐ)用量(ng= 0.02×載體(tǐ)堿基對數(shù),即 0.03 pmol

b. 插入單片段時(shí),最适片段用量(ng=0.04×片段堿基對數(shù);插入多(duō)片段時(shí),每片段最适用量 (ng= 0.02×片段堿基對數(shù)。

注 1:如果插入的單片段長度大(dà)于載體(tǐ),那(nà)麽應互換載體(tǐ)與插入片段用量;

注 2:如果插入的片段長度小(xiǎo)于 200 bp,那(nà)麽要使用 倍載體(tǐ)的用量;

注 3:如果按上(shàng)述公式計(jì)算(suàn)得(de)到的用量低(dī)于最低(dī)/高(gāo)于最高(gāo)值,那(nà)麽建 議直接按最低(dī)/最高(gāo)用量 使用

注 4:載體(tǐ)或插入片段過長,片段數(shù)量過多(duō),均會(huì)降低(dī)陽性率。

重組反應體(tǐ)系配制(zhì)完成後,輕輕吹吸數(shù)次混勻各組分,避免産生(shēng)氣泡即可(kě),切勿渦旋。

2. 将反應體(tǐ)系置于 50℃,反應 5-60 min。

注 1:推薦使用溫控比較精準的儀器(qì)進行(xíng)反應,如 PCR 儀,反應時(shí)間(jiān)不足或過長都會(huì)降 低(dī)克隆效率;

注 2:插入 1~2 個(gè)片段時(shí),推薦反應時(shí)間(jiān)為(wèi) 5~15 min;插入 3~5 個(gè)片段時(shí),推薦反 應 時(shí)間(jiān)為(wèi) 15~30 min

注 3:當載體(tǐ)骨架在 10 kb 以上(shàng)或插入片段在 4 kb 以上(shàng)時(shí),建議延長反應時(shí)間(jiān)到 30~60 min;

注 450℃反應完成後,建議進行(xíng)瞬時(shí)離心,将反應液收集至管底。

3. 将反應液離心管置于冰水(shuǐ)浴中冷卻,直接進行(xíng)轉化或儲存于-20℃。

注:-20℃儲存的重組産物,建議在 周內(nèi)使用。

五. 克隆産物轉化

在 100 μL 感受态細胞中加入 5-10 μL 反應液,輕柔吹吸混勻,置于冰上(shàng) 30min。42℃熱激 45~60s,冰浴 5 min。加入 500 μL SOC 或 LB 培養基,37℃振蕩培養 40-60 min(200 rpm)。将菌液均勻塗布在含相應抗生(shēng)素的平闆上(shàng),倒置于37℃培養箱培養過夜。

注 1:不同感受态細胞最後的克隆陽性率會(huì)有(yǒu)所差别,推薦使用轉化效率>10 8 cfu/μg 的感受 态細胞;

注 2PCR 産物與線性化載體(tǐ)的數(shù)量和(hé)純度決定了菌落數(shù);

注 3:陽性對照平闆通(tōng)常生(shēng)長大(dà)量白色單菌落,陰性對照平闆隻生(shēng)長很(hěn)少(shǎo)的菌落。

六. 陽性克隆檢測

菌落 PCR 鑒定:挑取單菌落置于 10 μL ddH2O 中混勻,95℃裂解 10 min,取1 μL作(zuò)模闆,進行(xíng)菌落 PCR 鑒定。

酶切鑒定:将單菌落接種到抗性培養基中培養過夜,提取質粒進行(xíng)酶切鑒定。

注 1:建議菌落 PCR 時(shí),至少(shǎo)使用一條通(tōng)用引物,可(kě)有(yǒu)效避免假陽性結果;

注 2: 必要時(shí)可(kě)進一步對陽性結果進行(xíng)測序鑒定