miRNAFirst-strand cDNASynthesis Kit
目錄号：PR155
産品內(nèi)容：
組成 PR155-01 （25次）
miRNA RT Enzyme Mix 50 μl
2×miRT Reaction Mix 250 μl
RNase free H2O 1 ml
産品儲存：－20 ℃ 保存。
制(zhì)品說明(míng)：miRNA 第一鏈合成試劑盒本試劑盒采用在 Poly(A)加尾法原理(lǐ)， 首先miRNA 3’末端加 Poly(A)尾，再使用 Anchored oligo(dT)-universal tag 通(tōng)用逆轉錄引物進行(xíng)逆轉錄反應，最終生(shēng)成 miRNA 對應的 cDNA 第一鏈。
本試劑盒采用特殊優化預混合 mix 将 Poly(A)加尾和(hé)反轉錄合并為(wèi)一步完成，簡化了操作(zuò)步驟并提高(gāo) Poly(A)加尾和(hé)逆轉錄效率，該試劑盒具有(yǒu)可(kě)從 20pg-2μg 的 total RNA 中有(yǒu)效制(zhì)備 miRNA 對應的 cDNA 第一鏈。一次合成的 cDNA 可(kě)檢測多(duō)個(gè) microRNA，節約了樣品和(hé)成本。
注：該試劑盒須與 miRNA 熒光定量檢測試劑盒（PR156）配套使用。
操作(zuò)步驟：
一、miRNA 3’末端進行(xíng)Poly (A)加尾和(hé)逆轉錄反應（第一鏈合成）
1. 解凍2 × miRNA RT Reaction Mix并混勻， miRT Enzyme Mix放于冰中備用，加入以下試劑至總體(tǐ)積20μl（最後加入miRNA RT Enzyme Mix）。
Components Volume（20 μl） Final Concentration
Total RNA x μl Up to 2μg
2 × miRT Reaction Mix 10 μl 1 ×
miRNA RT Enzyme Mix 2μl (見注意事項) -
RNase free H2O to final volume 20 μl -
注意事項：miRNA RT Enzyme Mix 非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和(hé)吸頭外導緻損失。
二、按照 miRNA 熒光定量檢測試劑盒（PR156）進行(xíng)real time PCR
*在反應中使用的total RNA 必須含有(yǒu)小(xiǎo)分子RNA（miRNA)。此過程也可(kě)以使用富集的miRNA，單純miRNA無法直接使用分光光度計(jì)定量，建議加入量為(wèi)2μl ~5μl。可(kě)根據目的miRNA豐度決定加入量，但(dàn)是對于低(dī)豐度miRNA 樣品而言(如血清血漿提取物)，可(kě)直接加入最大(dà)體(tǐ)積8 μl。
移液器(qì)輕輕混勻上(shàng)述配制(zhì)的反應液，短(duǎn)暫離心後在42℃反應60 min。85℃加熱5秒(miǎo)鍾失活miRNA RT Enzyme Mix ，合成的cDNA反應液可(kě)放置于-20℃保存；也可(kě)以直接進行(xíng)下遊PCR或者熒光定量PCR檢測。
注：按照上(shàng)述操作(zuò)步驟得(de)到的cDNA模闆用于下遊PCR或者熒光定量PCR檢測時(shí)，可(kě)以根據實際情況選擇使用量，對于特殊的檢測體(tǐ)系中，高(gāo)含量的cDNA模闆易導緻非特異性擴增，可(kě)根據所檢測miRNA的豐度适當的稀釋cDNA（5-10倍或者100倍）後使用。如果發現有(yǒu)非特異擴增條帶，或者融鏈曲線顯示有(yǒu)非特異擴增，往往提示cDNA模闆過量， 可(kě)以嘗試将上(shàng)述cDNA模闆稀釋幾十到幾百倍甚至上(shàng)千倍再使用。
