miRNA Real-Time PCR Assay kit
miRNA 熒光定量 PCR 檢測試劑盒
目錄号：PR156
産品內(nèi)容：
組成 PR156-01（50次） PR156-01（200次）
2 x miRNA qPCR Mix(With Sybr Green) 1.25 ml 1.25 ml×4
Reverse primer(10μM ) 55 μl 55 μl×4
産品組成、儲存：
-20 ℃ 避光保存至少(shǎo)6個(gè)月，使用前充分融解混勻。2 × miRNA qPCR Mix(With Sybr Green)短(duǎn)期使用可(kě)放在 4 ℃，避免反複凍融。Reverse primer(10μM )每次用完置-20 ℃保存。
制(zhì)品說明(míng)：miRNA 熒光定量 PCR 檢測試劑盒采用本試劑盒采用 SYBR® Green I 嵌合熒光法的原理(lǐ)進行(xíng) miRNA 熒光定量檢測。本試劑盒包含 miRNA 熒光 定量檢測的所有(yǒu)試劑，包括 2×miRNA qPCR Mix 和(hé) Reverse primer。2× miRNA qPCR Mix（含 Sybr Green）是專門(mén)為(wèi) miRNA 定量檢測而研發的 新一代預混形式的熒光定量 PCR 檢測試劑，其中的 DNA polymerase 采 用的是抗體(tǐ)修飾的熱啓動形式， 配合特殊的 Buffer 體(tǐ)系，使反應特異性更好，靈敏度更高(gāo)，并能在更廣的範圍內(nèi)進行(xíng)準确定量。
注：該試劑盒須與 miRNA 第一鏈合成試劑盒（PR155）配套使用。
需自備的試劑：
1. 分子生(shēng)物學實驗級别的水(shuǐ)（無核酸酶）
2. 待檢測miRNA對應的qPCR上(shàng)遊引物（Forward primer）
Forward Primer設計(jì)原則：
1. 遵循引物設計(jì)的最普遍原則。
2. 以成熟的miRNA 序列為(wèi)基礎，将U 替換成T，這是最基礎和(hé)最簡單的設計(jì)方法。
3. 試劑盒中提供的下遊引物的Tm 值為(wèi)65℃，設計(jì)上(shàng)遊引物的Tm65℃左右。
4. 若按照原則2 的方式直接設計(jì)的引物其Tm 值過低(dī)，可(kě)以在引物的5’端添加幾個(gè)堿基（最好為(wèi)G 或C 堿基）；也可(kě)以在3’端添加1 個(gè)或幾個(gè)A 堿基；或者5’端和(hé)3’端同時(shí)修飾。
5. 若按照原則2 的方式直接設計(jì)的引物其Tm 值過高(gāo)，可(kě)以在引物的5’或3’端去 掉幾個(gè)堿基。
注意事項：
1. miRNA 第一鏈cDNA 的加入量不要超過real time PCR 體(tǐ)積1/10。
2. 對于特殊的檢測體(tǐ)系中，高(gāo)含量的cDNA 模闆易導緻非特異性擴增，根據所檢測 miRNA 的豐度适當的稀釋cDNA（10倍或者100倍）。
3. 本品中含有(yǒu)熒光染料Sybr Green I，保存本品或配制(zhì)PCR反應液時(shí)應避免強光照射。
4. 2 x miRNA qPCR Mix不含參比染料ROX，客戶并根據qPCR儀器(qì)技(jì)術(shù)指導決定是否需要加ROX參比染料，用于消除信号本底以及校(xiào)正孔與孔之間(jiān)産生(shēng)的熒光信号誤 差，配套ROX産品貨号為(wèi)PR111-Rox Reference Dye。
操作(zuò)步驟：
1. 在室溫融化2 x miRNA qPCR Mix和(hé)Reverse primer（10μM）。
2. 使用時(shí)請(qǐng)将2 x miRNA qPCR Mix上(shàng)下颠倒輕輕均勻混合，避免起泡，并經輕微離心
後使用。如果試劑沒有(yǒu)混勻，其反應性能會(huì)有(yǒu)所下降。注：請(qǐng)不要使用振蕩器(qì)混勻。
3. 按照下表組分冰上(shàng)進行(xíng)反應液的配制(zhì)
注： 提高(gāo)特異性選擇兩步法。提高(gāo)擴增效率選擇三步法。
