一：簡述

Bradford法蛋白定量試劑盒是在世界上(shàng)常用的蛋白濃度檢測方法之一Bradford 法基礎上(shàng)(考馬斯亮藍(lán)結合顯色法)改進而成。當Bradford 染色液(考馬斯亮藍(lán))和(hé)蛋白在酸性條件下結合時(shí)，最大(dà)吸光值波長立刻由 465 nm轉移至 595nm，同時(shí)顔色由褐魚轉為(wèi)藍(lán)魚，通(tōng)過測定吸光值大(dà)小(xiǎo)并對照标準蛋白的吸光值，推算(suàn)出蛋白濃度。

二：組成

本産品收到後按照上(shàng)面指示溫度存放各成份，一年內(nèi)有(yǒu)效。蛋白标準長期保存-20℃放置，可(kě)4℃運輸。

三：産品特點

1.靈敏度高(gāo)，檢測濃度下限達到 25ugiml，最小(xiǎo)檢測蛋白量達到0.5ug待測樣品體(tǐ)積為(wèi) 1-20ul。

2. 檢測速度極快，10-20 個(gè)樣品隻需不足 10 分鍾即可(kě)完成。

3. 在50-1000ugml濃度範圍內(nèi)有(yǒu)較好的線性關系。

四：操作(zuò)步驟(實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項)

1. 完全溶解蛋白标準品(5mg/mlBSA)，取 10u稀釋至100u，使終濃度為(wèi) 0.5mg/ml。蛋白樣品在什麽溶液中，标準品也宜用什麽溶液稀釋。但(dàn)是為(wèi)了簡便起見，也可(kě)以用 0.9%NaCl 或 PBS 稀釋标準品。

2.将稀釋後标準品(0.5mg/mlBSA)按 0，1，2，4，8，12，16，20u分别加到 96孔闆中，加标準品稀釋液将所有(yǒu)标準品補足到 20。

3. 加适當體(tǐ)積樣品到 96 孔闆的樣品孔中，加标準品稀釋液補足到 20ul。

4.各孔加入200ulBradford 染色液，用加樣槍輕輕吹打混勻(注意不要弄出氣泡影(yǐng)響讀數(shù))室溫放置 3-5 分鍾。

5.用酶标儀測定 A595，或570-610nm之間(jiān)的其它波長的吸光度。

6. 根據标準曲線計(jì)算(suàn)出樣品中的蛋白濃度。

五：注意事項

1. Bradford 染色液含有(yǒu)刺激性或者腐蝕性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

2. Bradford 染色液中考馬斯亮藍(lán)易聚集成團，每次使用前請(qǐng)颠倒 6-8 次并且豎直抓住瓶口做(zuò)水(shuǐ)平劃圈動作(zuò)，旋轉瓶中液體(tǐ)，幫助充分混勻，但(dàn)不可(kě)以上(shàng)下振蕩混勻。

3.低(dī)溫會(huì)降低(dī) Bradford 染色液的敏感度，因此每次使用前應該使 Bradford 染色液回複到室溫。僅僅将需要的 Bradford 染色液複溫，可(kě)以減少(shǎo)複溫時(shí)間(jiān)。倒出每次需要的 Bradford 染色液回複到室溫，将原瓶放回冰箱。

4. 蛋白标準請(qǐng)在全部溶解後先混勻，再稀釋成一系列不同濃度的蛋白标準。标準品 曲線配制(zhì)時(shí)，如果吸量不準确或者加樣槍不精确會(huì)造成标準曲線相關系數(shù)減小(xiǎo)，可(kě)根據需要使用倍比梯度稀釋的方法來(lái)配制(zhì)，或者使用精确度高(gāo)的加樣槍。

5. 由于 Bradford 法在蛋白濃度增高(gāo)到一定時(shí)候，顔色反應并不成比例增加，因此得(de) 到的标準曲線隻是在一定範圍內(nèi)可(kě)以近似看成直線，每次應按照實際測得(de)的标準曲線計(jì)算(suàn)出大(dà)緻精确的蛋白濃度。

6. 需要酶标儀一台，最佳檢測波長為(wèi) 595nm，也可(kě)以在 570-610nm之間(jiān)波長測定， 但(dàn)會(huì)降低(dī)一些(xiē)敏感度;并需 96 孔闆。如果沒有(yǒu)酶标儀，也可(kě)以使用普通(tōng)的分光光度計(jì)測定，但(dàn)是測定蛋白濃度時(shí)，需根據測定吸光度的杯子的體(tǐ)積，按比例調整 Bradford 染色液和(hé)樣品的體(tǐ)積。使用分光光度計(jì)測定蛋白濃度時(shí)，每個(gè)試劑盒可(kě)以測定的樣品數(shù)量可(kě)能會(huì)顯著減少(shǎo)。

7. Bradford 法測定蛋白濃度不受絕大(dà)部分樣品中的化學物質的影(yǐng)響，樣品中巯基乙醇的濃度可(kě)高(gāo)達 1M，二硫蘇糖醇的濃度可(kě)高(gāo)達 5mM。但(dàn)受略高(gāo)濃度的去垢劑影(yǐng)響。需确保 SDS 低(dī)于 0.125%，Triton X-100 低(dī)于0.125%，Tween 20 低(dī)于0.06%。可(kě)以考慮用超純水(shuǐ)稀釋，透析/除鹽，ACETONE/TCA 沉澱蛋白後重溶于超純水(shuǐ)等方法來(lái)消除幹擾物質的影(yǐng)響。