1/适用範圍：

适用于從動物及人(rén)體(tǐ)血漿和(hé)血清中純化包括miRNA的總RNA。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存6個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項：

1、所有(yǒu)的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低(dī)時(shí)溶液可(kě)能形成沉澱，此時(shí)不應該直接使用，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清。

2、不合适的儲存于低(dī)溫（4℃或者－20℃）會(huì)造成溶液沉澱，影(yǐng)響使用效果，因此運輸和(hé)儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行(xíng)。

3、漂洗液B可(kě)能加入乙醇使用幾天後出現沉澱晶體(tǐ)，并不影(yǐng)響使用，直接不吸晶體(tǐ)，吸上(shàng)清使用就可(kě)以。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

近年來(lái)對RNA幹擾和(hé)調節性小(xiǎo)RNA的廣泛研究迫切需要一種能有(yǒu)效提取15-30核苷酸左右大(dà)小(xiǎo)RNA（包括siRNA和(hé)miRNA）的試劑盒。但(dàn)是傳統的RNA提取方法如矽膠膜不能有(yǒu)效吸附回收，酚/胍抽提和(hé)異丙醇或者乙醇沉澱并不能有(yǒu)效沉澱回收微小(xiǎo)分子RNA，對于血清血漿樣本更是由于其自身特點更難提取。本試劑盒采用獨特的裂解液迅速直接裂解血清血漿RNA酶，強烈有(yǒu)機抽提去除蛋白和(hé)DNA，RNA包括微小(xiǎo)分子RNA在高(gāo)濃度乙醇下吸附于離心柱內(nèi)特殊矽基質膜，再通(tōng)過一系列特殊漂洗液快速的漂洗－離心的步驟，漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質進一步去除，最後低(dī)鹽的洗脫液将純淨RNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、不需要異丙醇或者乙醇沉澱等容易喪失微小(xiǎo)分子RNA的步驟。

3、特殊的裂解液配方，可(kě)以處理(lǐ)更多(duō)的血清/血漿樣品。

4、多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，可(kě)用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和(hé)各種實驗。

6/注意事項

1、第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液A瓶和(hé)漂洗液B瓶中加入指定量乙醇，加入後請(qǐng)及時(shí)打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

2、除說明(míng)外，所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

3、需要自備乙醇，氯仿。

4、Lysis buffer 和(hé)漂洗液A含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

5、RNA 純度及濃度檢測：

一般情況下通(tōng)過測量OD260值可(kě)以知道(dào)RNA産量，測量OD260/OD280 比值可(kě)以是衡量蛋白質污染程度的指标之一，但(dàn)是由于血清/血漿的RNA含量特别低(dī)，已經低(dī)于分光光度計(jì)測量的下限，無法測量準确，因此一般無法通(tōng)過測量OD值或者比值的方法來(lái)判斷純度或者濃度，隻能通(tōng)過下遊做(zuò)熒光定量RT-PCR來(lái)判斷産量。同時(shí)無細胞的血清/血漿中的RNA主要是小(xiǎo)于100 nt的小(xiǎo)RNA，因此傳統的電(diàn)泳檢測RNA完整性并不适用于血清/血漿RNA。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液A瓶和(hé)漂洗液B瓶中加入指定量乙醇！

1、每250μl樣品(血清，血漿)加入750μl Lysis buffer，渦旋振蕩或者用加樣槍吹打液體(tǐ)樣品幾次混勻幫助裂解。 

對于含有(yǒu)高(gāo)污染物樣品如高(gāo)蛋白高(gāo)血脂樣品，可(kě)以适當減少(shǎo)處理(lǐ)量，不足的體(tǐ)積，可(kě)以用去RNase-free H2O補足。Lysis buffer和(hé)液體(tǐ)樣品的終體(tǐ)積比總是3：1。例如200μl樣品+50μl RNase-free H2O+750μl Lysis buffer。

2、将樣品劇(jù)烈震蕩混勻，在15 -30°C條件下孵育5分鍾。

3、每750μl Lysis buffer加200μl 氯仿，劇(jù)烈振蕩15秒(miǎo)并室溫下放置2分鍾。

4、于4℃12,000rpm 離心10分鍾，樣品會(huì)分成三層：下層有(yǒu)機相，中間(jiān)層和(hé)上(shàng)層無色的水(shuǐ)相，RNA存在于水(shuǐ)相中。水(shuǐ)相層的容量大(dà)約為(wèi)所加Lysis buffer體(tǐ)積的70%。

5、小(xiǎo)心取上(shàng)清（精确計(jì)算(suàn)體(tǐ)積）轉入到新的離心管，加入1.5倍體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇（必須是室溫的），渦旋混勻。此時(shí)可(kě)能出現沉澱,但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程,立即吹打混勻,不要離心，立刻接下步。

6、将混合物(每次小(xiǎo)于700μl,多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）12,000 rpm離心30-60秒(miǎo)，棄掉廢液。

7、加700μl 漂洗液A（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

8、加入500μl 漂洗液B（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。加入500μl 漂洗液B，重複一遍。

9、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

10、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加30-40μl RNase free water（事先在 100℃水(shuǐ)浴中預熱效果更好）， 室溫放置1分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。

洗脫液加回到吸附柱重複洗脫一遍可(kě)以提高(gāo)産量和(hé)濃度(如果需要RNA濃度高(gāo))。如果需要提高(gāo)濃度，洗脫體(tǐ)積最小(xiǎo)可(kě)以低(dī)至15μl，但(dàn)是使用小(xiǎo)體(tǐ)積洗脫會(huì)降低(dī)一些(xiē)産量。