1/适用範圍：

适用于快速提取各種全血/血清/血漿/液體(tǐ)樣本miRNA和(hé)總RNA。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒按照指示儲存6個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項

1、漂洗液A和(hé)漂洗液B加入無水(shuǐ)乙醇後，可(kě)以在常溫保存。

2、漂洗液B可(kě)能加入乙醇使用幾天後出現沉澱晶體(tǐ)，并不影(yǐng)響使用，直接不吸晶體(tǐ)，吸上(shàng)清使用就可(kě)以。

3、運輸在常溫下進行(xíng)，不影(yǐng)響使用效果。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

近年來(lái)對RNA幹擾和(hé)調節性小(xiǎo)RNA的廣泛研究迫切需要一種能有(yǒu)效提取15-30核苷酸左右大(dà)小(xiǎo)RNA（包括siRNA和(hé)miRNA）的試劑盒。但(dàn)是傳統的RNA提取方法如矽膠膜不能有(yǒu)效吸附回收，酚/胍抽提和(hé)乙醇沉澱并不能有(yǒu)效沉澱回收微小(xiǎo)分子RNA，對于血液樣本更是由于其自身特點更難提取。本試劑盒采用獨特的裂解液迅速直接裂解全血（液體(tǐ)樣本）和(hé)滅活細胞RNA酶，強烈有(yǒu)機抽提去除蛋白和(hé)DNA，RNA包括微小(xiǎo)分子RNA吸附于離心柱內(nèi)特殊矽基質膜， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟,漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質進一步去除， 最後低(dī)鹽的洗脫液将純淨RNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、不需要乙醇沉澱等容易喪失微小(xiǎo)分子RNA的步驟。

3、獨有(yǒu)的裂解液配方，可(kě)直接裂解全血，不需要先裂解去除紅細胞。

4、多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，基本無DNA殘留。可(kě)用于RNAi，RT-PCR，Northern-blot和(hé)各種實驗。

6/注意事項：

1、第一次使用前請(qǐng)先在70%乙醇、漂洗液A瓶和(hé)漂洗液B瓶中加入指定量乙醇，加入後請(qǐng)及時(shí)打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

2、所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

3、需要自備乙醇，氯仿。

4、Lysis buffer和(hé)漂洗液A含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗

5、預防RNase 污染，應注意以下幾方面：

1. ① 經常更換新手套。因為(wèi)皮膚經常帶有(yǒu)細菌，可(kě)能導緻RNase 污染。
2. ② 使用無RNase 的塑料制(zhì)品和(hé)槍頭避免交叉污染。
3. ③ RNA 在裂解液中時(shí)不會(huì)被RNase 降解。但(dàn)提取後繼續處理(lǐ)過程中應使用不含RNase 的塑料和(hé)玻璃器(qì)皿。玻璃器(qì)皿可(kě)在150℃烘烤4小(xiǎo)時(shí)，塑料器(qì)皿可(kě)在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鍾，然後用水(shuǐ)徹底清洗，再滅菌，即可(kě)去除RNase。
4. ④ 配制(zhì)溶液應使用無RNase 的水(shuǐ)。（将水(shuǐ)加入到幹淨的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高(gāo)壓滅菌。）

5、RNA 純度及濃度檢測：

完整性：RNA 可(kě)用普通(tōng)瓊脂糖凝膠電(diàn)泳 (電(diàn)泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電(diàn)泳緩沖液；150v，15分鍾)檢測完整性。由于細胞中70%-80%的RNA 為(wèi)rRNA，電(diàn)泳後UV 下應能看到非常明(míng)顯的rRNA 條帶。動物rRNA 大(dà)小(xiǎo)分别約為(wèi)5 kb 和(hé)2kb，分别相當于28S和(hé)18S rRNA。動物RNA 樣品中最大(dà)rRNA 亮度應為(wèi)次大(dà)rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明(míng)樣品嚴重降解。

純度：OD260/OD280比值是衡量蛋白質污染程度的指标。高(gāo)質量的RNA，OD260/OD280讀數(shù)（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間(jiān)。OD260/OD280讀數(shù)受測定所用溶液的pH 值影(yǐng)響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間(jiān)，在水(shuǐ)溶液中所測讀數(shù)則可(kě)能在1.5-1.9 之間(jiān)，但(dàn)這并不表示RNA 不純。

濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水(shuǐ)稀釋n 倍，用RNase-free水(shuǐ)将分光光度計(jì)調零，取稀釋液進行(xíng)OD260，OD280測定，按照以下公式進行(xíng)RNA濃度的計(jì)算(suàn)：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù)n)×40。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在70%乙醇、漂洗液A瓶和(hé)漂洗液B瓶中加入指定量乙醇！

1、每0.25ml液體(tǐ)樣品(血清，血漿，腦(nǎo)脊液等等)加入0.75ml Lysis buffer，用加樣槍吹打液體(tǐ)樣品幾次以幫助裂解樣品中細胞。每5~10×106個(gè)細胞至少(shǎo)加入0.75ml Lysis buffer。對于含有(yǒu)高(gāo)污染物樣品如全血樣品，可(kě)以用滅菌水(shuǐ)按照1：1比例稀釋一倍後開(kāi)始提取。Lysis buffer和(hé)液體(tǐ)樣品的終體(tǐ)積比總是3：1。

2、将樣品劇(jù)烈震蕩混勻，在15 -30°C條件下孵育5分鍾以使核蛋白體(tǐ)完全分解。

3、每0.75ml Lysis buffer加0.2 ml氯仿，劇(jù)烈振蕩15秒(miǎo)并室溫下放置2分鍾。

4、于4℃12,000 rpm 離心10分鍾，樣品會(huì)分成三層：下層有(yǒu)機相，中間(jiān)層和(hé)上(shàng)層無色的水(shuǐ)相，RNA存在于水(shuǐ)相中。水(shuǐ)相層的容量大(dà)約為(wèi)所加Lysis buffer體(tǐ)積的70%。

5、小(xiǎo)心取上(shàng)清（精确計(jì)算(suàn)體(tǐ)積）轉入到新的離心管，加入1.5倍體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇（必須是室溫的），渦旋混勻。此時(shí)可(kě)能出現沉澱，但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即吹打混勻，不要離心，立刻接下步。

6、将混合物(每次小(xiǎo)于700μl,多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）12,000 rpm離心30-60秒(miǎo)，棄掉廢液。

7、加700μl 漂洗液A（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

8、加入500μl 漂洗液B（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。加入500μl 漂洗液B，重複一遍。

9、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

10、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加30-50μl RNase free water（事先在 100℃水(shuǐ)浴中預熱效果更好）， 室溫放置1分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。

11、如果預期RNA産量>30μg,加30-50μl RNase free water重複步驟10, 合并兩次洗脫液,或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重複步驟一遍(如果需要RNA濃度高(gāo))。

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高(gāo), 分兩次洗脫合并洗脫液的RNA産量比前者高(gāo)1 5–30%, 但(dàn)是濃度要低(dī),用戶根據需要選擇。

8/附：microRNA富集方法（僅僅提取microRNA，不包含>200 nt其它總RNA成份。）

1、按照前面标準操作(zuò)步驟1－5操作(zuò)，直到得(de)到上(shàng)清。

2、較精确估計(jì)上(shàng)清體(tǐ)積，加入等體(tǐ)積70％乙醇（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!）（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

3、将混合物加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）12,000 rpm離心30-60秒(miǎo)，收集濾過物。将濾過物從收集管CT轉移到一個(gè)新的離心管後，把吸附柱子放回空(kōng)的收集管CT內(nèi)，再加入剩下的混合物，離心，收集濾過物。合并兩次濾過物，計(jì)算(suàn)體(tǐ)積。此時(shí)，濾過物含有(yǒu)microRNA, 吸附柱子上(shàng)面是除去了microRNA的總RNA（不包含microRNA），如果需要，可(kě)以按照前面标準操作(zuò)步驟7－10操作(zuò)漂洗，洗脫回收得(de)到去除了microRNA的總RNA。

4、較精确估計(jì)濾過物體(tǐ)積，加入0.65倍體(tǐ)積無水(shuǐ)乙醇（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

5、取一套新的microRNA吸附柱MA， 将上(shàng)一步驟混合物(每次小(xiǎo)于700μl，多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入microRNA吸附柱MA中，（吸附柱放入收集管CT中）12,000 rpm離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

6、按照前面标準操作(zuò)步驟7－10操作(zuò)漂洗，洗脫得(de)到富集的microRNA。

注意：不同的實驗可(kě)以選擇不同的方法，例如Northern Blot或者表達芯片譜分析可(kě)以選擇提取包括microRNA的總RNA。富集方法提取的microRNA因為(wèi)去除了較大(dà)片段的mRNA和(hé)rRNA等，可(kě)能減少(shǎo)某些(xiē)下遊試驗的擴增背景，當背景較高(gāo)或者非特異擴增較多(duō)時(shí)，可(kě)以嘗試使用富集方法提取的microRNA。