1/适用範圍：

适用于快速從福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣品中提取RNA包括microRNA，RNA可(kě)直接用于反轉錄PCR，熒光定量PCR。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存9個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項：

1、所有(yǒu)的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低(dī)時(shí)溶液可(kě)能形成沉澱，此時(shí)不應該直接使用，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清。

2、不合适的儲存于低(dī)溫（4℃或者－20℃）會(huì)造成溶液沉澱，影(yǐng)響使用效果，因此運輸和(hé)儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行(xíng)。

3、為(wèi)避免降低(dī)活性，方便運輸，提供蛋白酶K為(wèi)凍幹粉狀，收到後，可(kě)短(duǎn)暫離心後，加入0.5毫升滅菌水(shuǐ)溶解。因為(wèi)反複凍融可(kě)能會(huì)降低(dī)酶活性，因此溶解後立即按照每次使用量)分裝凍存，－20℃保存。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

本試劑盒設計(jì)用于快速從福爾馬林固定、石蠟包埋組織樣品中提取RNA包括microRNA。獨特的裂解液/蛋白酶K迅速裂解細胞釋放出RNA，然後裂解混合物通(tōng)過一個(gè)基因組DNA清除柱，基因組DNA被清除而RNA穿透濾過。濾過的RNA用乙醇調節結合條件後,RNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗-離心的步驟, 去蛋白液和(hé)漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最後低(dī)鹽的RNase free H20将純淨RNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。得(de)到的RNA可(kě)用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

5/産品特點：

1、完全不使用有(yǒu)毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

2、快速，簡捷，單個(gè)樣品RNA提取操作(zuò)一般可(kě)在1小(xiǎo)時(shí)內(nèi)完成。

3、試劑盒的獨家(jiā)基因組清除柱和(hé)配方确保有(yǒu)效清除基因組DNA殘留，一般情況下得(de)到的RNA不需要DNase消化，可(kě)直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

4、多(duō)次柱漂洗确保RNA高(gāo)純度，可(kě)直接用于下遊各種實驗。

6/注意事項

1、所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

2、樣品處理(lǐ)量絕對不要超過基因組DNA清除柱CC和(hé)RNA吸附柱AC處理(lǐ)能力，否則造成DNA殘留或者産量降低(dī)。不同組織細胞種類RNA/DNA相差極大(dà)，例如胸腺脾髒DNA含量豐富，超過5mg就會(huì)超過柱子處理(lǐ)能力。COS細胞RNA含量豐富，超過3x106細胞就會(huì)超過柱子吸附能力。所以開(kāi)始摸索實驗條件時(shí)，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時(shí)甯可(kě)使用較少(shǎo)的樣品處理(lǐ)量，如不超過2個(gè)10μm厚度石蠟切片。将來(lái)根據樣品試驗情況增加或者減少(shǎo)處理(lǐ)量。

3、裂解液PKD、結合液RBC中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

4、預防RNase 污染，應注意以下幾方面：

1. ① 經常更換新手套。因為(wèi)皮膚經常帶有(yǒu)細菌，可(kě)能導緻RNase 污染。
2. ② 使用無RNase 的塑料制(zhì)品和(hé)槍頭避免交叉污染。
3. ③ RNA提取過程中應使用不含RNase 的塑料和(hé)玻璃器(qì)皿。玻璃器(qì)皿可(kě)在150℃烘烤4 小(xiǎo)時(shí)，塑料器(qì)皿可(kě)在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鍾，然後用水(shuǐ)徹底清洗，再滅菌，即可(kě)去除RNase。
4. ④ 配制(zhì)溶液應使用無RNase 的水(shuǐ)。（将水(shuǐ)加入到幹淨的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高(gāo)壓滅菌。）

5、關于DNA 的微量殘留：

一般說來(lái)任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做(zuò)到100%無殘留），本公司的GenePure固定包埋組織microRNA快速提取試劑盒，由于采取了本公司獨特的緩沖體(tǐ)系和(hé)基因組DNA清除柱技(jì)術(shù)，絕大(dà)多(duō)數(shù)DNA已經被清除，可(kě)直接用于反轉錄PCR和(hé)熒光定量PCR。個(gè)别特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行(xíng)嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行(xíng)模闆和(hé)引物的選擇時(shí)：

  ① 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作(zuò)為(wèi)模闆參與擴增反應。

  ② 選擇基因組DNA和(hé)cDNA上(shàng)擴增的産物大(dà)小(xiǎo)不一樣的引物對。

6、RNA 純度及濃度檢測：

完整性： RNA 可(kě)用普通(tōng)瓊脂糖凝膠電(diàn)泳 (電(diàn)泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電(diàn)泳緩沖液；150v，15 分鍾)檢測完整性。由于石蠟包埋組織福爾馬林固定和(hé)包埋過程中一般由于RNA與蛋白反應交聯會(huì)導緻RNA斷裂或者降解，一般電(diàn)泳後UV 下隻能看到模糊彌散（smear）帶型，随着儲存的時(shí)間(jiān)越長，降解斷裂越嚴重，甚至隻能看到峰值僅僅在100bp左右的模糊條帶。這都屬于RNA提取正常情況。

純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質污染程度的參考指标。高(gāo)質量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間(jiān)。OD260/OD280 讀數(shù)受測定所用溶液的pH 值影(yǐng)響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間(jiān)，在水(shuǐ)溶液中所測讀數(shù)則可(kě)能在1.5-1.9 之間(jiān)，但(dàn)這并不表示RNA 不純。

濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水(shuǐ)稀釋n 倍，用RNase-free水(shuǐ)将分光光度計(jì)調零，取稀釋液進行(xíng)OD260, OD280 測定，按照以下公式進行(xíng)RNA濃度的計(jì)算(suàn)：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù)n)×40。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RB瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇!

1、修整去除過量包埋組織外石蠟，并切片成10-20μm厚切片。

切片厚度必須≥10μm，否則太薄會(huì)切碎細胞，造成脫蠟過程中microRNA丢失。

2、收集總厚度不超過■40μm的石蠟切片到一個(gè)1.5-2ml離心管（例如2片20μm、4片10μm的石蠟切片），或者不超過▲80μm的石蠟切片到一個(gè)2ml離心管。

■代表處理(lǐ)切片總厚度≤40μm，▲代表處理(lǐ)切片總厚度≤80μm

3、加入1ml 100%二甲苯，渦旋振蕩10秒(miǎo)。瞬間(jiān)離心把組織全部浸入到二甲苯。

4、50℃水(shuǐ)浴3分鍾熔解石蠟，20-25℃最高(gāo)速離心2分鍾，收集組織到管底。

5、小(xiǎo)心用移液器(qì)吸棄上(shàng)清二甲苯，注意不要吸到沉澱。

6、加入1ml無水(shuǐ)乙醇，渦旋振蕩，最高(gāo)速離心2分鍾，小(xiǎo)心吸棄上(shàng)清乙醇。

7、加入1ml無水(shuǐ)乙醇，重複步驟6一遍，盡可(kě)能吸棄所有(yǒu)乙醇。

8、室溫或者37℃ 晾幹乙醇10分鍾或直到所有(yǒu)乙醇揮發幹。

乙醇完全晾幹非常重要，微量的乙醇殘留也會(huì)導緻RNA産量降低(dī)。

9、吹打或者渦旋振蕩充分重懸組織沉澱在■150μl ▲240μl 裂解液PKD中，短(duǎn)暫離心收集液體(tǐ)到管底，加10μl 蛋白酶K，吹打混勻。

10、55℃孵育15分鍾，然後80 ℃孵育15分鍾。

55℃孵育後，可(kě)以将離心管取出放置在室溫，等水(shuǐ)浴鍋溫度升到80℃後再放入水(shuǐ)浴鍋，精确的孵育15分鍾。即使2分鍾的延長也可(kě)能導緻RNA的部分降解。

11、加入■320μl ▲500μl 結合液RBC，充分吹打混勻調節結合條件。

12、立刻将混合物加入一個(gè)基因組DNA清除柱CC中，（清除柱CC放入收集管CT中）14,000 rpm離心30秒(miǎo)，保留濾過液（RNA在濾過液中）。

應避免吸到可(kě)能有(yǒu)的較大(dà)的未消化完全的絮團物質上(shàng)柱子，以免堵塞離心柱。

13、加入■1120μl ▲1750μl 無水(shuǐ)乙醇到濾過液中，立即吹打混勻，不要離心。

如果加1750μl無水(shuǐ)乙醇，應先将濾過液轉到容量超過3ml的離心管後再加入。

14、立刻将混合物(每次小(xiǎo)于700μl，多(duō)可(kě)以分多(duō)次加入)加入一個(gè)RNA吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）13,000 rpm離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

15、加入500μl漂洗液RB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RB,重複一遍。

16、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

17、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加30μl RNase free water（事先在 70-90℃水(shuǐ)浴中加熱可(kě)提高(gāo)産量）， 室溫放置1分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要RNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積，如果需要RNA濃度高(gāo)，可(kě)以将洗脫液放回吸附柱AC，再洗脫一遍。