目錄号：PE101

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

特别提醒：

試劑盒使用時(shí)請(qǐng)提前準備無水(shuǐ)乙醇和(hé)異丙醇。

儲存事項：

1、第一次使用時(shí)，将試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液A後，置于2-8℃保存。如果溶液A中RNase A失活，提取的質粒可(kě)能會(huì)有(yǒu)微量RNA殘留，在溶液A中補加RNase A即可(kě)。

2、環境溫度低(dī)時(shí)溶液B和(hé)溶液C中可(kě)能會(huì)析出渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

産品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的矽基質膜在高(gāo)鹽、低(dī)pH值狀态下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通(tōng)過去蛋白液和(hé)漂洗液将雜質和(hé)其它細菌成分去除，最後低(dī)鹽、高(gāo)pH值的洗脫緩沖液将純淨質粒DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、快速、方便，不需要使用有(yǒu)毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱。獲得(de)的質粒産量高(gāo)、純度好， 可(kě)以直接用于酶切、轉化、PCR、體(tǐ)外轉錄、測序等各種分子生(shēng)物學實驗。

注意事項：

1、本試劑盒适用菌株為(wèi)XL-1 Blue、Top10和(hé)DH5α等核酸酶含量低(dī)缺陷型菌株。所用菌株為(wèi)JM系列、HB101等endA菌株或野生(shēng)型菌株，核酸酶含量豐富，應購買本公司生(shēng)産的高(gāo)純度質粒小(xiǎo)量快速提取試劑盒（PE102）。

2、所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的傳統台式離心機。

3、溶液C中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

4、提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有(yǒu)關。一般高(gāo)拷貝質粒，建議接種單菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生(shēng)素的LB培養基， 過夜培養14-16個(gè)小(xiǎo)時(shí)，可(kě)提取出多(duō)達20µg的純淨質粒。如果所提質粒為(wèi)低(dī)拷貝質粒或大(dà)于10kb的大(dà)質粒，應适當加大(dà)菌體(tǐ)使用量，使用5-10 ml過夜培養物，同時(shí)按比例增加A、B、C的用量，其它步驟相同。

5、得(de)到的質粒DNA可(kě)用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和(hé)紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD260值為(wèi)1相當于大(dà)約50μg/ml DNA。電(diàn)泳可(kě)能為(wèi)單一條帶，也可(kě)能為(wèi)2條或者多(duō)條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時(shí)間(jiān)長短(duǎn)、提取時(shí)操作(zuò)劇(jù)烈程度等有(yǒu)關。本公司産品正常操作(zuò)情況下基本超螺旋可(kě)以超過90%。

6、質粒DNA确切分子大(dà)小(xiǎo)， 必須酶切線性化後，對比DNA分子量Marker才可(kě)以知道(dào)。處于環狀或者超螺旋狀态的的質粒，泳動位置不确定，無法通(tōng)過電(diàn)泳知道(dào)其确切大(dà)小(xiǎo)。

7、洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA，不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫，但(dàn)應該确保pH大(dà)于7.5，pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫質粒應該保存在－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

     ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記，以免多(duō)次加入!

     ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液BS瓶中加入指定量異丙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記，以免多(duō)次加入!

     ● 将RNase A全部加入溶液A中，混勻，每次使用後置于2-8℃保存。

1、将帶有(yǒu)質粒的E.coli接種于5 mL LB/抗生(shēng)素培養液中，37℃搖床培養12~16 h。

2、取1.0~5.0 mL的菌液，室溫下10,000rpm離心1 min，盡可(kě)能的倒幹上(shàng)清，收集菌體(tǐ)。

收集超過1.5 ml菌液，可(kě)以離心棄上(shàng)清後，在同一個(gè)1.5 ml管內(nèi)加入更多(duō)的菌液，重複步驟，直到收集到足夠的菌體(tǐ)。

3、加入250 µl溶液A/RNaseA混合液，漩渦振蕩使菌體(tǐ)完全懸浮。

如果有(yǒu)未徹底混勻的菌塊，會(huì)影(yǐng)響裂解，導緻提取量和(hé)純度偏低(dī)。

4、往重懸混合液中加入250 µl溶液B，輕輕颠倒混勻6-8次使菌體(tǐ)充分裂解。

溫和(hé)地混合，不要劇(jù)烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時(shí)間(jiān)不應超過5分鍾！以免質粒受到破壞。此時(shí)菌液應變得(de)清亮粘稠，如果菌體(tǐ)少(shǎo)，很(hěn)快清亮粘稠後就可(kě)以做(zuò)下一步，不是一定要準确的5分鍾。

5、加入350 μl溶液C，立即輕輕颠倒混勻6-8，充分混勻至出現白色絮狀沉澱。13,000rpm離心10分鍾，小(xiǎo)心取上(shàng)清。

加入溶液C後應該立即混勻，以免産生(shēng)SDS的局部沉澱。

6、将上(shàng)一步所得(de)上(shàng)清加入吸附柱AD中（吸附柱AD放入收集管CT中）， 13,000rpm離心1分鍾，倒掉收集管CT中的廢液。

7、把柱子重新裝回收集管，加入500 µl平衡液BS（請(qǐng)先檢查是否已加入異丙醇!），室溫下13,000rpm離心1分鍾，棄去廢液。

8、加入700 μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），13,000rpm 離心1分鍾，棄掉廢液。

9、加入700 μl漂洗液WB，13,000rpm 離心1分鍾，棄掉廢液。

10、将吸附柱AD放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

11、取出吸附柱AD，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加30-100 μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液使用前在 65-70℃水(shuǐ)浴中加熱效果更好），室溫放置2分鍾，13,000rpm 離心1分鍾。如果需要較多(duō)量質粒，可(kě)将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)。如果需要質粒濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于30 μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)質粒洗脫效率，減少(shǎo)質粒産量。

12、将洗脫的DNA保存在-20℃。