Yeast HiPure Plasmid Maxi Kit

酵母高(gāo)純度質粒大(dà)量快速提取試劑盒

目錄号：PE114

适用範圍：

适用于大(dà)規模高(gāo)純度酵母質粒制(zhì)備。

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

儲存事項:

1、第一次使用時(shí)，将試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液YA（終濃度100µg/ml）置于4℃保存。如果溶液YA中RNase A失活，提取的質粒可(kě)能會(huì)有(yǒu)微量RNA殘留，在溶液YA中補加RNase A即可(kě)。

2、環境溫度低(dī)時(shí)溶液YB中SDS可(kě)能會(huì)析出渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

産品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結合破壁酶LE特異消化酵母細胞壁，能在1小(xiǎo)時(shí)內(nèi)從酵母培養液中分離出高(gāo)純度質粒DNA。酵母收集後,加入破壁酶LE去除細胞壁後,然後堿裂法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的矽基質膜在高(gāo)鹽、低(dī)PH值狀态下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通(tōng)過去蛋白液和(hé)漂洗液将雜質和(hé)其它細菌成分去除， 最後低(dī)鹽、高(gāo)PH值的洗脫緩沖液将純淨質粒DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、快速、方便，不需要使用有(yǒu)毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱。獲得(de)的質粒産量高(gāo)、純度好，可(kě)以直接用于酶切、轉化、PCR、體(tǐ)外轉錄、測序等各種分子生(shēng)物學實驗。

注意事項

1、所有(yǒu)的離心步驟如未加另外說明(míng)均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到至少(shǎo)6,000xg，帶50ml轉頭的台式離心機。

2、溶液YC和(hé)去蛋白液PD中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

3、通(tōng)常酵母質粒拷貝數(shù)都很(hěn)低(dī)，高(gāo)拷貝質粒最大(dà)得(de)率一般為(wèi)每5 ml 培養物提取1μg左右的質粒。用于下遊試驗時(shí)通(tōng)常建議使用量為(wèi)： 1-5μl用做(zuò)PCR 模闆;5-10μl 用于轉化大(dà)腸杆菌,選擇高(gāo)效率的感受态細胞。

4、得(de)到的質粒DNA可(kě)用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和(hé)紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD260值為(wèi)1相當于大(dà)約50μg/ml DNA。電(diàn)泳可(kě)能為(wèi)單一條帶，也可(kě)能為(wèi)2條或者多(duō)條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成， 與提取物培養時(shí)間(jiān)長短(duǎn)、提取時(shí)操作(zuò)劇(jù)烈程度等有(yǒu)關。本公司産品正常操作(zuò)情況下基本超螺旋可(kě)以超過90%。

5、用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山(shān)梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。配制(zhì)方法：在600 ml 去離子水(shuǐ)裏面溶解 182.2克山(shān)梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調節PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.1%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩爾濃度一般為(wèi)14M)。

6、菌體(tǐ)濃度檢測一般OD600值為(wèi)1的時(shí)候,釀酒酵母細胞是1-2x107 cells/ml，由于菌種和(hé)分光度計(jì)不同即使同樣細胞數(shù)量OD值變化也很(hěn)大(dà)，以上(shàng)僅供參考。

7、洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA，不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫，但(dàn)應該确保批pH大(dà)于7.5， pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫質粒應該保存在－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

    ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

    ● 将RNase A全部加入溶液YA中，混勻。每次使用後置于2-8℃保存。

    ● 将溶液YC放在冰上(shàng)預冷。

    ● 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.1%β-巯基乙醇，回複到室溫備用。

1、取約100-180毫升酵母培養物，6000xg，離心10分鍾，盡可(kě)能的倒幹上(shàng)清，收集菌體(tǐ)。

收集超過50毫升菌液，可(kě)以離心棄上(shàng)清後，在同一個(gè)50ml管內(nèi)加入更多(duō)的菌液，重複步驟1，直到收集到足夠的菌體(tǐ)。

2、加入10ml Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；加入0.1g 破壁酶LE（破壁酶LE臨用前用2ml Sorbitol buffer溶解），充分颠倒混勻，37℃溫育1-2小(xiǎo)時(shí)消化細胞壁，中間(jiān)可(kě)颠倒數(shù)次幫助消化。

如果破壁效果不好導緻質粒産量過低(dī)，可(kě)以加大(dà)破壁酶LE用量來(lái)提高(gāo)酶工作(zuò)濃度，還(hái)可(kě)以延長消化時(shí)間(jiān)或者提高(gāo)溫度到45℃來(lái)提高(gāo)效果，不适合破壁消化的酵母可(kě)選用Lyticase 或者Zymolase或者其它方法如加玻璃珠渦旋振蕩，反複凍融等。

3、6000xg，離心10分鍾，盡可(kě)能吸棄上(shàng)清，加入7ml溶液YA重懸菌體(tǐ)沉澱，渦旋振蕩至徹底懸浮。  

如果有(yǒu)未徹底混勻的菌塊，會(huì)影(yǐng)響裂解，導緻提取量和(hé)純度偏低(dī)。

4、加7ml的溶液YB，溫和(hé)地上(shàng)下翻轉4 -7次使菌體(tǐ)充分裂解，室溫放置4分鍾。

溫和(hé)地混合，不要劇(jù)烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時(shí)間(jiān)不應超過5分鍾！以免質粒受到破壞。此時(shí)菌液應變得(de)清亮粘稠，如果菌體(tǐ)少(shǎo)，很(hěn)快清亮粘稠後就可(kě)以做(zuò)下一步，不是一定要準确的5分鍾。如果未變得(de)清亮，可(kě)能由于菌體(tǐ)過多(duō)，裂解不徹底，應減少(shǎo)菌體(tǐ)量。

5、加10ml溶液YC，立即溫和(hé)地上(shàng)下翻轉4 -7次，充分混勻此時(shí)會(huì)出現白色絮狀沉澱。冰上(shàng)靜置5-10分鍾，4℃ ，至少(shǎo)2500xg離心20分鍾(加大(dà)離心力可(kě)相應縮短(duǎn)離心時(shí)間(jiān),如15000xg離心10分鍾)，小(xiǎo)心取上(shàng)清，避免吸取到漂浮的白色沉澱。

加入溶液YC後應該立即混勻，以免産生(shēng)SDS的局部沉澱，如果上(shàng)清中還(hái)有(yǒu)飄浮白色沉澱，可(kě)再次離心後取上(shàng)清。

6、可(kě)選,一般不需要:4℃，2500xg 再次離心10 分鍾，小(xiǎo)心取上(shàng)清。

7、将上(shàng)一步所得(de)上(shàng)清加入吸附柱DC中（吸附柱DC放入收集管CT中），靜置2分鍾，2500xg離心2分鍾，倒掉收集管CT中的廢液。

如果上(shàng)清體(tǐ)積超過20ml，可(kě)以分多(duō)次過柱。

8、加入10ml去蛋白液PD，2500xg離心2分鍾，棄掉廢液。

9、加入10ml漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），2500xg離心2分鍾，棄掉廢液。

10、重複操作(zuò)步驟9一次。

11、将吸附柱DC放回空(kōng)收集管CT中，最高(gāo)速（最好大(dà)于9000xg，如果離心機轉速低(dī)，需要相應延長離心時(shí)間(jiān)）離心10分鍾以幹燥膜基質殘留乙醇，用槍頭吸除內(nèi)圈壓環和(hé)柱壁之間(jiān)可(kě)能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾幹幾分鍾。

該步驟目的為(wèi)徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應并且嚴重降低(dī)洗脫效率，降低(dī)質粒産量。如果洗脫産量低(dī)，則必須加做(zuò)步驟12。

12、可(kě)選步驟: 選擇以下兩種方法之一幹燥柱子：

        ① 取下柱子放置于真空(kōng)容器(qì)中，密封真空(kōng)容器(qì)，提供真空(kōng)15分鍾；

        ② 将柱子放置于60－65℃真空(kōng)幹燥箱或烘箱中，放置10-15分鍾。

13、取出吸附柱DC，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加1ml洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中預熱效果更好），室溫放置2分鍾，6000 xg離心5分鍾。如果需要較多(duō)量質粒，可(kě)将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心2分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要質粒濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于0.6ml，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)質粒洗脫效率，減少(shǎo)質粒産量。