大(dà)型大(dà)量質粒提取試劑盒(溶液型,轉染級)
PE112-06
20次/盒,6盒/箱
适用于大(dà)量高(gāo)純或者轉染級質粒制(zhì)備和(hé)BAC/PAC大(dà)型質粒制(zhì)備
規格 價格
6盒 ¥11200

目錄号:PE112

 

适用範圍:

适用于大(dà)量高(gāo)純或者轉染級質粒制(zhì)備和(hé)BAC/PAC大(dà)型質粒制(zhì)備。

 

 

試劑盒組成、儲存、穩定性:

試劑盒組成

保存

20次(PE112-01)

RNaseA(10mg/ml)

-20℃

1.3ml

溶液A

4℃

130ml

溶液B

室溫

100 ml

溶液E

室溫

110 ml

雜質清除劑A

室溫

3 ml

雜質清除劑B

室溫

30 ml

內(nèi)毒素清除劑ER

-20℃

10 ml


本試劑盒在室溫儲存18個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

 

 

儲存事項:

1、第一次使用時(shí),将試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液A後(終濃度100μg /ml)置于4℃保存。如果溶液A中RNase A失活,提取的質粒可(kě)能會(huì)混雜有(yǒu)微量RNA殘留,在溶液A中補加RNase A即可(kě)。

2、內(nèi)毒素清除劑ER在4℃可(kě)保存一個(gè)月,如果要長期保存,建議保存在-20℃!

3、環境溫度低(dī)時(shí)溶液B中SDS可(kě)能會(huì)析出出現渾濁或者沉澱,可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾,即可(kě)恢複澄清,不要劇(jù)烈搖晃,以免形成過量的泡沫。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化,各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子

 

 

産品介紹:

本試劑盒用堿裂解法從培養菌中提取質粒DNA,采用獨特的溶液配方和(hé)內(nèi)毒素清除試劑,隻需要幾次簡單離心去除蛋白質、多(duō)糖、內(nèi)毒素、RNA等雜質,獲得(de)高(gāo)質量的質粒DNA。純化DNA的OD260/280通(tōng)常在1.8左右,得(de)到的質粒可(kě)直接應用于細胞轉染甚至動物體(tǐ)內(nèi)實驗等對DNA純度要求很(hěn)高(gāo)的工作(zuò)中。純化後期過程均在1.5ml小(xiǎo)離心管中操作(zuò),方法簡單,不需特殊設備,無需過柱,不用酚氯仿抽提;基本可(kě)完全回收細菌裂解釋放出的質粒,不必擔心質粒DNA的丢失。本方法提取純化質粒DNA,對質粒損傷小(xiǎo),即使是10kb甚至100kb以上(shàng)的大(dà)型質粒或超大(dà)型BAC/PAC質粒,隻要堿裂解法能夠提取,就可(kě)以有(yǒu)效純化。可(kě)選擇任意小(xiǎo)體(tǐ)積溶解質粒,濃度可(kě)高(gāo)達5μg/μl。超螺旋比例可(kě)高(gāo)達95%,無內(nèi)毒素,轉染效果好。

 

 

産品特點:

1、不需要使用有(yǒu)毒的苯酚,氯仿等試劑,也不需要乙醇沉澱。快速、 方便、從150-200 ml大(dà)腸杆菌LB((Luria-Bertani)培養液中,可(kě)快速提取0.5-2mg純淨的高(gāo)拷貝質粒DNA,提取率達80-90 %。

2、獲得(de)的質粒産量高(gāo),超螺旋比例可(kě)高(gāo)達95%,濃度可(kě)達5μg/μl,純度好,可(kě)直接用于酶切、轉化、PCR、體(tǐ)外轉錄、測序等各種分子生(shēng)物學實驗。

3、內(nèi)毒素含量極低(dī)(< 0.1EU/μg DNA),可(kě)直接應用于細胞轉染。

 

 

注意事項

1、提取的質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有(yǒu)關。如果所提質粒為(wèi)低(dī)拷貝質粒或大(dà)于10kb 的大(dà)質粒,應加大(dà)菌體(tǐ)使用量,同時(shí)按比例增加A、B、E的用量。

2、提取大(dà)質粒時(shí)操作(zuò)動作(zuò)要輕柔,應該使用剪大(dà)了開(kāi)口的吸頭,防止機械剪切對DNA的損壞。

3、DNA沉澱液沉澱離心後,可(kě)能看不到明(míng)顯沉澱。如未見沉澱,擔心DNA丢失,可(kě)保留上(shàng)清液,待完成全部操作(zuò)後電(diàn)泳鑒定,以确定是否獲得(de)終産物(數(shù)百微克DNA離心沉澱在管的側壁上(shàng),可(kě)能無法看到明(míng)顯團塊)。

4、得(de)到的質粒DNA可(kě)用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和(hé)紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD260值為(wèi)1相當于大(dà)約50μg/ml DNA。電(diàn)泳可(kě)能為(wèi)單一條帶,也可(kě)能為(wèi)2條或者多(duō)條DNA條帶,這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成,與提取物培養時(shí)間(jiān)長短(duǎn)、提取時(shí)操作(zuò)劇(jù)烈程度等有(yǒu)關。本公司産品正常操作(zuò)情況下基本超螺旋可(kě)以超過95%。

5、質粒DNA确切分子大(dà)小(xiǎo), 必須酶切線性化後,對比DNA分子量Marker才可(kě)以知道(dào)。處于環狀或者超螺旋狀态的質粒,泳動位置不确定,無法通(tōng)過電(diàn)泳知道(dào)确切大(dà)小(xiǎo)。

 

 

操作(zuò)步驟:(實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項)

提示:将RNase A全部加入溶液A中,混勻,使用後置于2-8℃保存。

1、取過夜培養菌150 ml左右菌液(最大(dà)不超過180ml-200ml),裝入合适的離心瓶中,10,000 x g于4℃離心2 min沉澱菌體(tǐ),完全棄除上(shàng)清。

2、加入5 ml 溶液A,充分混懸震蕩菌體(tǐ)沉澱,使其完全分散開(kāi),至無絮塊存在。細菌懸液移入50 ml離心管中,室溫放置3~5 min。  

如果有(yǒu)未徹底混勻的菌塊,會(huì)影(yǐng)響裂解,導緻提取量和(hé)純度偏低(dī)。

3、加入5 ml 溶液B,輕輕颠倒離心管6~8次,室溫放置4-5 min,使細菌完全裂解,溶液透明(míng)。

溫和(hé)地混合,不要劇(jù)烈震蕩,以免基因組DNA剪切斷裂!所用時(shí)不應超過5分鍾!以免質粒受到破壞。此時(shí)菌液應變得(de)清亮粘稠,如果菌體(tǐ)少(shǎo),很(hěn)快清亮粘稠後就可(kě)以做(zuò)下一步,不是一定要準确的5分鍾。如果未變得(de)清亮,可(kě)能由于菌體(tǐ)過多(duō),裂解不徹底,應減少(shǎo)菌體(tǐ)量。

4、加5 ml溶液E,立即颠倒離心管6~8次,充分混勻,至白色絮狀物産生(shēng)。上(shàng)述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g離心10~15 min,小(xiǎo)心吸出上(shàng)清,移入新的50 ml離心管中。

加入溶液E後應該立即混勻,以免産生(shēng)SDS的局部沉澱。

5、加入10 ml 異丙醇,颠倒離心管,充分混勻。

注意: 使用異丙醇沉澱,蛋白雜質和(hé)鹽離子共沉澱較少(shǎo),可(kě)能看不到明(míng)顯的較大(dà)團塊沉澱,但(dàn)是質粒還(hái)是可(kě)以完全沉澱下來(lái),不影(yǐng)響實際的質粒産量。如果你(nǐ)習慣看見較大(dà)的沉澱團塊操作(zuò),可(kě)以選擇2倍體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇沉澱。

6、于4℃ 12,000~16,000 x g離心10 min,小(xiǎo)心棄去上(shàng)清,倒置于吸水(shuǐ)紙上(shàng)輕輕瀝幹殘餘液體(tǐ),加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍,最高(gāo)速離心5分鍾,棄上(shàng)清,晾幹沉澱。

DNA沉澱如果幹燥過頭,DNA将無法完全溶解,但(dàn)是如果乙醇沒有(yǒu)晾幹揮發幹淨,殘留太多(duō),也會(huì)造成DNA無法完全溶解。

注意:異丙醇離心沉澱後,質粒純度很(hěn)高(gāo)吸附在管底和(hé)側壁可(kě)能看不見沉澱,但(dàn)是不影(yǐng)響産量,後續步驟仔細吹打管底和(hé)沉澱所在的側壁涮洗溶解質粒。

7、加入1.4 ml 溶液A完全溶解沉澱團塊,注意附着在管底和(hé)側壁上(shàng)的質粒沉澱雖然可(kě)能看不見,也要吹打管底和(hé)沉澱所在的側壁涮洗下來(lái)(大(dà)質粒可(kě)用寬口吸管輕輕吹打輔助溶解)。然後将質粒溶液轉入2個(gè)新的1.5 ml離心管中(每個(gè)700μl)。可(kě)選步驟(一般不需要):如果菌株RNA豐富有(yǒu)微量RNA殘留,可(kě)在此步驟後将質粒溶液 60℃孵育15 min消化RNA。

8、每管加入55μl雜質清除液A,颠倒充分混勻後加入約0.1體(tǐ)積(約80μl)冰預冷的內(nèi)毒素清除劑ER,颠倒旋轉7-10次(30秒(miǎo)左右)充分混勻,冰浴或者冰上(shàng)放置>=5分鍾,中間(jiān)偶爾颠倒混勻幾次。

內(nèi)毒素清除劑ER加入上(shàng)清後,上(shàng)清會(huì)變得(de)渾濁,但(dàn)是冰浴後應恢複清亮。

注意:如果不需要去內(nèi)毒素用于轉染,可(kě)在此步驟隻加入55μl雜質清除液A,充分混勻後冰上(shàng)放置5分鍾,離心後小(xiǎo)心取上(shàng)清轉入一個(gè)新管,直接接步驟11。

9、42℃水(shuǐ)浴,溶液又會(huì)變為(wèi)渾濁,颠倒混勻後42℃溫育5分鍾。

10、室溫14,000 x g離心5 min分相(溫度低(dī)時(shí),內(nèi)毒素清除劑ER無法分相,因此必須至少(shǎo)20℃以上(shàng)室溫離心或者保證冬季轉頭溫度20℃以上(shàng))。上(shàng)層水(shuǐ)相含DNA,下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和(hé)其它雜質。将含DNA的上(shàng)層水(shuǐ)相轉移到新管(注意不要吸到藍(lán)色油狀層,裏面含內(nèi)毒素等雜質),棄油狀層。

溶液必須分為(wèi)上(shàng)下兩相,否則應重複步驟9-10

11、将上(shàng)一步所得(de)上(shàng)層水(shuǐ)相中加入等體(tǐ)積雜質清除液B(約750μl),輕柔混勻,4℃ 14,000 x g離心10 min,棄上(shàng)清(注意不要丢失DNA),輕輕加入1 ml 70%乙醇洗滌,離心棄上(shàng)清,共兩次,室溫倒置晾幹5~10 min使乙醇完全揮發。

12、每個(gè)離心管加适量TE或者純水(shuǐ)(100~200μl)溶解沉澱(可(kě)在37℃水(shuǐ)浴中振蕩以輔助溶解)。要注意很(hěn)多(duō)質粒DNA可(kě)能附着在離心管側壁上(shàng),即使看不見,也應該充分吹打側壁溶解回收質粒DNA。

最後沉澱可(kě)以根據需要選擇任意小(xiǎo)體(tǐ)積溶解這樣可(kě)以得(de)到很(hěn)高(gāo)濃度的轉染級質粒DNA(高(gāo)達5-10μg/μl)。如果有(yǒu)需要,客戶也可(kě)以選擇更大(dà)體(tǐ)積溶解。