目錄号：PE104

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

儲存事項:

1、第一次使用時(shí)，将試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液YA（終濃度100µg/ml）置于4℃保存。如果溶液YA中RNase A失活，提取的質粒可(kě)能會(huì)有(yǒu)微量RNA殘留，在溶液YA中補加RNase A即可(kě)。

2、環境溫度低(dī)時(shí)溶液YB中SDS可(kě)能會(huì)析出渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3、Lytic Enzyme為(wèi)蝸牛酶甘油儲液，因此比較粘稠，請(qǐng)小(xiǎo)心取用，－20℃保存。 蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和(hé)消化道(dào)中制(zhì)備的混合酶，它含有(yǒu)纖維素酶，果膠酶，澱粉酶，蛋白酶等20多(duō)種酶。适合破碎溶解各種酵母的細胞壁。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

産品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞并結合Lytic Enzyme特異消化酵母細胞壁，能在1小(xiǎo)時(shí)內(nèi)從酵母培養液中分離出高(gāo)純度質粒DNA。酵母收集後，加入破壁酶去除細胞壁後，然後堿裂法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的矽基質膜在高(gāo)鹽、低(dī)PH值狀态下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通(tōng)過去蛋白液和(hé)漂洗液将雜質和(hé)其它細菌成分去除， 最後低(dī)鹽、高(gāo)PH值的洗脫緩沖液将純淨質粒DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

關于平衡液BS的使用

介紹：核酸吸附矽膠膜柱子長期放置過程中會(huì)同空(kōng)氣中的電(diàn)荷/塵埃發生(shēng)反應而影(yǐng)響其核酸的結合能力。矽膠柱經平衡液BS預處理(lǐ)後可(kě)大(dà)大(dà)減少(shǎo)柱子中矽膠膜的憎水(shuǐ)基團，提高(gāo)核酸的結合能力。從而提高(gāo)矽膠柱子回收效率或者産量。平衡液BS是強堿性溶液，若不小(xiǎo)心碰到，請(qǐng)用大(dà)量自來(lái)水(shuǐ)清洗。用完後需蓋緊瓶蓋，以免接觸空(kōng)氣。室溫保存。在保存過程中可(kě)能有(yǒu)沉澱生(shēng)成，請(qǐng)加熱至37℃使沉澱完全消失。

使用方法：取一個(gè)新的矽膠膜吸附柱子裝在收集管CT中，吸取100μl的平衡液BS至柱子中。13000 rpm離心1分鍾，倒掉收集管CT中廢液，将吸附柱子重新放回收集管CT。此時(shí)平衡液BS預處理(lǐ)柱子完畢。接後續的操作(zuò)步驟。

注意事項

1、所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的傳統台式離心機。

2、溶液YC和(hé)去蛋白液PS中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

3、通(tōng)常酵母質粒拷貝數(shù)都很(hěn)低(dī)，一般通(tōng)過電(diàn)泳或者分光光度計(jì)都很(hěn)難檢測到。提取的質粒如果用于下遊試驗時(shí)通(tōng)常建議使用量為(wèi)： 1-5μl用做(zuò)PCR 模闆;5-10μl 用于轉化大(dà)腸杆菌,選擇商業化的高(gāo)效率的感受态細胞。

4、用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山(shān)梨醇， 0.1M Na2EDTA，28 mMβ-巯基乙醇)。配制(zhì)方法：在600 ml 去離子水(shuǐ)裏面溶解 182.2克山(shān)梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調節PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.2%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩爾濃度一般為(wèi)14M)。

5、菌體(tǐ)濃度檢測一般OD600值為(wèi)1的時(shí)候,釀酒酵母細胞是1-2x107 cells/ml，由于菌種和(hé)分光度計(jì)不同即使同樣細胞數(shù)量OD值變化也很(hěn)大(dà)，以上(shàng)僅供參考。

6、洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA，不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫，但(dàn)應該确保pH大(dà)于7.5， pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫質粒應該保存在－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

     ● 第一次使用前請(qǐng)先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

     ● 将RNase A全部加入溶液YA中，混勻，每次使用後置于2-8℃保存。

     ● 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.2%β-巯基乙醇，回複到室溫備用。

1、取1.5-5毫升酵母培養物(不超過5X107 cells)，9,000rpm離心30秒(miǎo)，盡可(kě)能的吸棄上(shàng)清，收集菌體(tǐ)。

收集超過1.5毫升菌液，可(kě)以離心棄上(shàng)清後，在同一個(gè)1.5ml管內(nèi)加入更多(duō)的菌液，重複步驟1，直到收集到足夠的菌體(tǐ)。

2、加入300μl Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；再加入50μl Lytic Enzyme儲液，充分颠倒混勻，37℃溫育1-3小(xiǎo)時(shí)消化細胞壁，中間(jiān)可(kě)颠倒數(shù)次幫助消化。

如果破壁效果不好導緻質粒産量低(dī)，可(kě)以加大(dà)Lytic Enzyme 用量來(lái)提高(gāo)酶工作(zuò)濃度，還(hái)可(kě)以延長消化時(shí)間(jiān)或者提高(gāo)溫度到45℃來(lái)提高(gāo)效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可(kě)選用其它方法如0.5mm玻璃珠渦旋擊打 ，反複凍融等。玻璃珠法：向菌體(tǐ)中加入250μl溶液YA(請(qǐng)先檢查是否已加入RNase A)重懸沉澱，徹底懸浮菌體(tǐ)，加入0.1g直徑為(wèi)0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠，渦旋振蕩10分鍾，靜置幾分鍾讓玻璃珠沉澱，小(xiǎo)心吸取上(shàng)清到一個(gè)新管後接後續步驟4。

3、13,000rpm離心1分鍾，盡可(kě)能吸棄上(shàng)清，加入250μl溶液YA重懸菌體(tǐ)沉澱，渦旋振蕩至徹底懸浮。  

如果有(yǒu)未徹底混勻的菌塊，會(huì)影(yǐng)響裂解，導緻提取量和(hé)純度偏低(dī)。

4、加250μl的溶液YB，溫和(hé)地上(shàng)下翻轉4 -7次使菌體(tǐ)充分裂解，室溫放置4分鍾。

溫和(hé)地混合，不要劇(jù)烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時(shí)間(jiān)不應超過5分鍾！以免質粒受到破壞。此時(shí)菌液應變得(de)清亮粘稠，如果菌體(tǐ)少(shǎo)，很(hěn)快清亮粘稠後就可(kě)以做(zuò)下一步，不是一定要準确的5分鍾。

5、加350μl溶液YC，立即溫和(hé)地上(shàng)下翻轉4 -7次，充分混勻時(shí)會(huì)出現白色絮狀沉澱。13,000rpm離心10分鍾，小(xiǎo)心取上(shàng)清。

加入溶液YC後應該立即混勻，以免産生(shēng)SDS的局部沉澱。

平衡液BS預處理(lǐ)吸附柱：

使用平衡液BS預處理(lǐ)矽膠膜吸附柱為(wèi)必做(zuò)步驟，具體(tǐ)方法參見前文“關于平衡液BS的使用”

6、将上(shàng)一步所得(de)上(shàng)清加入吸附柱EC中（吸附柱EC放入收集管CT中）， 12,000rpm離心30-60秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。

7、加入500μl去蛋白液PS（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30-60秒(miǎo)，棄廢液。

8、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30-60秒(miǎo)，棄掉廢液。

9、加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30-60秒(miǎo)，棄掉廢液。

10、将吸附柱EC放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

11、取出吸附柱EC，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加50-100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中加熱效果更好），室溫放置2分鍾，13,000rpm 離心1分鍾。如果需要較多(duō)量質粒，可(kě)将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)。如果需要質粒濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于50μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)質粒洗脫效率，減少(shǎo)質粒産量。