質粒大(dà)量提取試劑盒(離心柱型)
PE109-01
10次
規格 價格
10次 ¥756

目錄号:PE109

 

試劑盒組成、儲存、穩定性:

試劑盒組成

保存

10(PE109-01)

RNaseA(10mg/ml)

-20℃

750µl

溶液A

4℃

77 ml

溶液B

室溫

77 ml

溶液D 

室溫

77 ml

漂洗液WB

室溫

25 ml X 2       

第一次使用前按說明(míng)加指定量乙醇

洗脫緩沖液EB

室溫

20 ml

吸附柱DC

室溫

10個(gè)

收集管CT(50ml)

室溫

10個(gè)

 

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

 

 

儲存事項:

1、第一次使用時(shí),将試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液A後(終濃度100μg/ml)置于4℃保存。如果溶液A中RNase A失活,提取的質粒可(kě)能會(huì)有(yǒu)微量RNA殘留,在溶液A中補加RNase A即可(kě)。

2、環境溫度低(dī)時(shí)溶液B中SDS可(kě)能會(huì)析出出現渾濁或者沉澱,可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾,即可(kě)恢複澄清,不要劇(jù)烈搖晃,以免形成過量的泡沫。

3、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化,各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

 

 

産品介紹:

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞,離心吸附柱內(nèi)的矽基質膜在高(gāo)鹽、低(dī)pH值狀态下選擇性地結合溶液中的質粒DNA,再通(tōng)過去蛋白液和(hé)漂洗液将雜質和(hé)其它細菌成分去除,最後低(dī)鹽、高(gāo)pH值的洗脫緩沖液将純淨質粒DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

 

 

産品特點:

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜,柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo),可(kě)重複性好。

2、不需要使用有(yǒu)毒的苯酚、氯仿等試劑,也不需要乙醇沉澱。快速、方便,從150-300ml大(dà)腸杆菌LB((Luria-Bertani)培養液中,可(kě)快速提取0.2-1.5mg純淨的高(gāo)拷貝質粒DNA,提取率達80 %左右。

3、獲得(de)的質粒産量高(gāo)、超螺旋比例高(gāo)、純度好,可(kě)以直接用于酶切、轉化、PCR、體(tǐ)外轉錄、測序等各種分子生(shēng)物學實驗。

 

 

注意事項

1、本試劑盒适用菌株為(wèi)XL-1 Blue、Top10和(hé)DH5α等核酸酶含量低(dī)缺陷型菌株。所用菌株為(wèi)JM系列、HB101等endA菌株或野生(shēng)型菌株,核酸酶含量豐富,應購買本公司生(shēng)産的高(gāo)純度質粒大(dà)量快速提取試劑盒(PE110)

2、所有(yǒu)的離心步驟如未加另外說明(míng)均在室溫完成,使用轉速可(kě)以達到12,000 x g,帶50ml轉頭的台式離心機。

3、提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有(yǒu)關。如果所提質粒為(wèi)低(dī)拷貝質粒或大(dà)于10kb 的大(dà)質粒,應加大(dà)菌體(tǐ)使用量,同時(shí)按比例增加A、B、D的用量,洗脫緩沖液應在70℃預熱。可(kě)以适當的延長吸附和(hé)洗脫的時(shí)間(jiān),提高(gāo)提取效率。

4、得(de)到的質粒DNA可(kě)用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和(hé)紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD260值為(wèi)1相當于大(dà)約50μg/ml DNA。電(diàn)泳可(kě)能為(wèi)單一條帶,也可(kě)能為(wèi)2條或者多(duō)條DNA條帶,這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成,與提取物培養時(shí)間(jiān)長短(duǎn)、提取時(shí)操作(zuò)劇(jù)烈程度等有(yǒu)關。本公司産品正常操作(zuò)情況下基本超螺旋可(kě)以超過90%。

5、質粒DNA确切分子大(dà)小(xiǎo),必須酶切線性化後,對比DNA分子量Marker才可(kě)以知道(dào)。處于環狀或者超螺旋狀态的質粒,泳動位置不确定,無法通(tōng)過電(diàn)泳知道(dào)其确切大(dà)小(xiǎo)。

6、洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA,不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫, 但(dàn)應該确保pH大(dà)于7.5,pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫,質粒應該保存-20℃。質粒DNA如果需要長期保存,可(kě)以用TE緩沖液洗脫 (10mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH 8.0),但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應,使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

 

 

操作(zuò)步驟:(實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項)

提示:

    ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇,充分混勻,加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇,以免多(duō)次加入!

    ● 将RNase A全部加入溶液A中,混勻。每次使用後置于2-8℃保存。

 

1、取150-200 ml (最多(duō)不超過300 ml)過夜培養的菌液,12,000 x g(約10,000rpm),離心1-2分鍾,盡可(kě)能的倒幹上(shàng)清,收集菌體(tǐ)。

收集超過50毫升菌液,可(kě)以離心棄上(shàng)清後,在同一個(gè)50ml管內(nèi)加入更多(duō)的菌液,重複步驟1,直到收集到足夠的菌體(tǐ)。

2、用7.5ml溶液A重懸菌體(tǐ)沉澱,移液器(qì)吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。  

如果有(yǒu)未徹底混勻的菌塊,會(huì)影(yǐng)響裂解,導緻提取量和(hé)純度偏低(dī)。

3、加7.5ml的溶液B,溫和(hé)地上(shàng)下翻轉6-8次使菌體(tǐ)充分裂解,室溫放置4-5分鍾。

溫和(hé)地混合,不要劇(jù)烈震蕩,以免基因組DNA剪切斷裂!所用時(shí)間(jiān)不應超過5分鍾!以免質粒受到破壞。此時(shí)菌液應變得(de)清亮粘稠。如果很(hěn)渾濁,可(kě)能由于菌體(tǐ)過多(duō),裂解不徹底,應減少(shǎo)菌體(tǐ)量。

4、加7.5ml溶液D,立即溫和(hé)地上(shàng)下翻轉6 -8次,充分混勻此時(shí)會(huì)出現白色絮狀沉澱。12,000 x g離心10-15分鍾,小(xiǎo)心取上(shàng)清至新管,避免吸取到漂浮的白色沉澱。

加入溶液D後應該立即混勻,以免産生(shēng)SDS的局部沉澱。

5、向上(shàng)清中加入0.5體(tǐ)積異丙醇(約10ml)後充分颠倒混勻後分多(duō)次(每次不超過15ml)轉入吸附柱DC中(吸附柱放入收集管CT中),12,000 x g離心1分鍾,倒掉收集管CT中的廢液。直到所有(yǒu)混合溶液通(tōng)過此吸附柱。

6、加入10ml漂洗液WB(請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!),12,000 x g離心1分鍾,棄掉廢液。再加入10ml漂洗液WB,重複漂洗一次。

7、将吸附柱DC放回空(kōng)收集管CT中,最高(gāo)速(最好大(dà)于12,000 x g)離心3分鍾以幹燥基質膜上(shàng)殘留乙醇,用槍頭吸除內(nèi)圈壓環和(hé)柱壁之間(jiān)可(kě)能殘留的乙醇,打開(kāi)蓋子室溫晾幹3-5分鍾。

該步驟為(wèi)徹底去除吸附柱中殘留乙醇,殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應并且嚴重降低(dī)洗脫效率,降低(dī)質粒産量

8、取出吸附柱DC,放入一個(gè)幹淨的離心管中,在吸附膜的中間(jiān)部位加1-2ml洗脫緩沖液EB(洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中預熱可(kě)提高(gāo)産量),室溫放置3分鍾,12,000 x g離心3分鍾。 

推薦:為(wèi)了增加質粒的回收效率,可(kě)将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中,室溫放置3分鍾,12,000 x g離心3分鍾。洗脫兩遍可(kě)提高(gāo)濃度約10%。

洗脫體(tǐ)積越大(dà),洗脫效率越高(gāo),如果需要質粒濃度較高(gāo),可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積, 但(dàn)是需注意體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)質粒洗脫效率,減少(shǎo)質粒産量(最小(xiǎo)不應少(shǎo)于1ml)