1/适用範圍：

适用于快速提取複雜植物組織細胞總RNA，使用獨有(yǒu)基因組DNA清除柱技(jì)術(shù)可(kě)有(yǒu)效清除電(diàn)泳可(kě)見gDNA殘留，RNA可(kě)用于反轉錄PCR，熒光定量PCR等。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項：

1、不合适的儲存于低(dī)溫（4℃或者－20℃）會(huì)造成溶液沉澱，影(yǐng)響使用效果，因此運輸和(hé)儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行(xíng)。

2、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

本公司在獨家(jiā)推出GenePure無苯酚、氯仿RNA快速提取技(jì)術(shù)基礎上(shàng)，又獨家(jiā)研發成功基因組DNA清除柱技(jì)術(shù)可(kě)以有(yǒu)效清除gDNA殘留，得(de)到的RNA一般不需要DNase消化，可(kě)用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。獨特的裂解液迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞RNA酶， 離心沉澱去除多(duō)糖多(duō)酚和(hé)次級代謝産物，然後裂解混合物用乙醇調節RNA結合吸附到基因組DNA清除柱，然後RNA被選擇性洗脫濾過，吸附在基因組DNA清除柱上(shàng)的殘留DNA無法洗脫連同柱子一起丢棄從而清除掉DNA。濾過的RNA用乙醇調節結合條件後，RNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜，再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟，去蛋白液和(hé)漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最後低(dī)鹽的RNase free H20将純淨RNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

1、完全不使用有(yǒu)毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

2、簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在25分鍾內(nèi)完成，世界上(shàng)最簡單快速的試劑盒。

3、獨家(jiā)研發成功基因組DNA清除柱技(jì)術(shù)可(kě)以有(yǒu)效清除gDNA殘留，得(de)到的RNA一般不需要DNase消化，可(kě)用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

4、适應性極其廣泛，可(kě)以提取包括複雜中草藥、複雜澱粉種子、複雜果實、複雜抗逆植物、複雜花(huā)卉、複雜多(duō)糖植物等數(shù)百種國內(nèi)外試劑盒提取失敗的樣品。

5、多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.2，基本無DNA殘留,可(kě)用于RT-PCR，Northern-blot，二代測序和(hé)各種實驗。

6/注意事項

1、所有(yǒu)的離心步驟均可(kě)在室溫完成（4℃離心也可(kě)以），使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

2、需要自備β-巯基乙醇，乙醇，研缽(可(kě)選)。

3、樣品處理(lǐ)量絕對不要超過基因組清除柱CC和(hé)和(hé)RNA吸附柱AC處理(lǐ)能力，否則造成DNA殘留或産量降低(dī)。開(kāi)始摸索實驗條件時(shí)，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時(shí)可(kě)使用較少(shǎo)的樣品處理(lǐ)量，将來(lái)根據樣品試驗情況增加或者減少(shǎo)處理(lǐ)量。

4、裂解液CLB和(hé)LBT Plus 和(hé)去蛋白液PRS中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

5、關于DNA 的微量殘留:

一般說來(lái)任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做(zuò)到100%無殘留），本公司的GenePure Plus RNA提取産品，由于采取了本公司獨特的緩沖體(tǐ)系和(hé)基因組DNA清除柱技(jì)術(shù)，絕大(dà)多(duō)數(shù)DNA已經被清除，不需要DNase消化，可(kě)直接用于反轉錄PCR和(hé)熒光定量PCR。個(gè)别特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行(xíng)嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行(xíng)模闆和(hé)引物的選擇時(shí)：

1. ① 選用跨內(nèi)含子的引物，以穿過mRNA中的連接區(qū)，這樣DNA就不能作(zuò)為(wèi)模闆參與擴增反應。
2. ② 選擇基因組DNA和(hé)cDNA上(shàng)擴增的産物大(dà)小(xiǎo)不一樣的引物對。
3. ③ 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理(lǐ)。本試劑盒還(hái)可(kě)以用于DNase I處理(lǐ)後的RNA清潔(cleanup) ，請(qǐng)聯系我們索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。
4. ④ 步驟去蛋白液PRS漂洗前，直接在吸附柱AC上(shàng)進行(xíng)DNase I柱上(shàng)消化處理(lǐ)。購買DNA酶柱上(shàng)消化試劑盒(貨号：RE128)前可(kě)先索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

    ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RB瓶加入指定量無水(shuǐ)乙醇!

    ● 取1ml裂解液 CLB至離心管內(nèi)(如果CLB有(yǒu)析出或者沉澱需先置于65°C水(shuǐ)浴重新溶解），在裂解液CLB中加入5% β-巯基乙醇（1ml CLB加50μl β-巯基乙醇）。颠倒混勻後65°C水(shuǐ)浴中預熱。多(duō)個(gè)樣品按照比例放大(dà)準備。

1、直接研磨法（實驗室無液氮情況下或者柔軟易研磨植物樣品推薦此法）:

a.  新鮮植物組織或者冰凍保存樣品稱重後取100-200mg（水(shuǐ)分少(shǎo)的樣品如葉片種子等可(kě)加100-150mg，水(shuǐ)分多(duō)的樣品如草莓西瓜果實可(kě)多(duō)加一些(xiē)）迅速剪成小(xiǎo)塊放入研缽，加入 1ml CLB（已加有(yǒu)β-巯基乙醇）室溫下充分研磨成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和(hé)裂解液CLB立刻充分接觸以抑制(zhì)RNA酶活性。

β-巯基乙醇是裂解液CLB的關鍵成分，必要的時(shí)候可(kě)以提高(gāo)終濃度到10-20%。

如果特别複雜植物，可(kě)以嘗試在裂解液中加入PVP40至終濃度2%。

b.  将裂解物轉入離心管，立即劇(jù)烈振蕩15秒(miǎo)，短(duǎn)時(shí)放回 65°C水(shuǐ)浴中（5-10 min），中間(jiān)偶爾颠倒1-2次幫助裂解。13,000rpm離心10分鍾，沉澱不能裂解的碎片。

c.  取裂解物上(shàng)清（在不超過基因組DNA清除柱CC能力的情況下可(kě)以取更多(duō)的上(shàng)清，這樣可(kě)以提高(gāo)産量）轉到一個(gè)新離心管。加入上(shàng)清體(tǐ)積一半的無水(shuǐ)乙醇(0.5體(tǐ)積)，此時(shí)可(kě)能出現沉澱，但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

若上(shàng)清表面有(yǒu)漂浮物，用吸頭挑開(kāi)吸取下面液體(tǐ)即可(kě)。

d.  立刻接操作(zuò)步驟的步驟3。

2、液氮研磨法（适用廣泛，提取複雜難破碎，易降解樣品時(shí)推薦此法）:

a.  液氮中研磨新鮮或-70°C冷凍的材料至細粉。

b.  轉移100-200mg細粉（水(shuǐ)分少(shǎo)的樣品如葉片種子等可(kě)加100-150mg，水(shuǐ)分多(duō)的樣品如草莓西瓜果實可(kě)多(duō)加一些(xiē)）加至預熱的裂解液CLB（已加有(yǒu)β-巯基乙醇）離心管中。立即劇(jù)烈渦旋30-60秒(miǎo)或者用吸頭吹打混勻裂解直得(de)到滿意勻漿結果(或者電(diàn)動勻漿30秒(miǎo))，可(kě)以剪切DNA，降低(dī)粘稠度和(hé)提高(gāo)産量。

c.  短(duǎn)時(shí)放回 65°C水(shuǐ)浴中（5-10 min），中間(jiān)偶爾颠倒1-2次幫助裂解。

d.  将裂解物13,000 rpm離心10分鍾，沉澱不能裂解的碎片。

e.  取裂解物上(shàng)清（在不超過基因組DNA清除柱CC能力的情況下可(kě)以取更多(duō)的上(shàng)清，這樣可(kě)以提高(gāo)産量）轉到一個(gè)新離心管。加入上(shàng)清體(tǐ)積一半的無水(shuǐ)乙醇(0.5體(tǐ)積)，此時(shí)可(kě)能出現沉澱，但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

若上(shàng)清表面有(yǒu)漂浮物，用吸頭挑開(kāi)吸取下面液體(tǐ)即可(kě)。

f.  立刻接操作(zuò)步驟的步驟3。

3、将混合物(每次小(xiǎo)于720μl，多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入一個(gè)基因組清除柱CC中，（清除柱CC放入收集管CT中）13,000 rpm離心2分鍾，棄掉廢液。

确保離心後液體(tǐ)全部濾過去，膜上(shàng)沒有(yǒu)殘留，如有(yǒu)必要，可(kě)以加大(dà)離心力和(hé)離心時(shí)間(jiān)。

4、将基因組DNA清除柱CC放在一個(gè)幹淨2ml離心管內(nèi)（不用RNAse free 或者DEPC處理(lǐ)，一般幹淨的新離心管即可(kě)。也可(kě)使用RNA吸附柱配套的新的幹淨收集管CT），在基因組清除柱CC內(nèi)加500μl裂解液LBT Plus，13,000 rpm離心30秒(miǎo)， 收集濾液（RNA在濾液中），用微量移液器(qì)較精确估計(jì)濾過液體(tǐ)積（通(tōng)常為(wèi)450-500μl左右，濾過時(shí)候損失體(tǐ)積應該減去），加入0.5倍體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇，此時(shí)可(kě)能出現沉澱，但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

5、立刻将混合物(每次小(xiǎo)于720μl，多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）13,000 rpm離心2分鍾，棄掉廢液。

确保離心後液體(tǐ)全部濾過去，膜上(shàng)沒有(yǒu)殘留，如有(yǒu)必要，可(kě)以加大(dà)離心力和(hé)離心時(shí)間(jiān)。

6、加700μl 去蛋白液PRS，室溫放置1分鍾，13,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

7、加入500μl漂洗液RB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），13,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RB，重複一遍。

8、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

9、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水(shuǐ)浴中加熱可(kě)提高(gāo)産量）， 室溫放置1分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。

10、如果預期RNA産量>30μg，加30-50μl RNase free water重複步驟9，合并兩次洗液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重複步驟一遍(如果需要RNA濃度高(gāo))。

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高(gāo),分兩次洗脫合并洗脫液的RNA産量比前者高(gāo)15–30%,但(dàn)是濃度要低(dī),用戶根據需要選擇。

8/附錄：RNA含量少(shǎo)樣品或者RNA複雜産量低(dī)的解決方案     

可(kě)以提高(gāo)樣品處理(lǐ)量到300-500mg/2ml裂解液CLB，上(shàng)清過兩根基因組DNA清除柱CC，洗脫下來(lái)的RNA，可(kě)以兩個(gè)合并到一根RNA吸附柱上(shàng)，可(kě)以大(dà)大(dà)提高(gāo)RNA濃度。