試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒按照指示儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

儲存事項：

1、所有(yǒu)的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低(dī)時(shí)溶液可(kě)能形成沉澱，此時(shí)不應該直接使用，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清。

2、不合适的儲存于低(dī)溫（4℃或者－20℃）會(huì)造成溶液沉澱，影(yǐng)響使用效果，因此運輸和(hé)儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行(xíng)。

3、Lytic Enzyme為(wèi)蝸牛酶甘油儲液，因此比較粘稠，請(qǐng)小(xiǎo)心取用，－20℃保存。 蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和(hé)消化道(dào)中制(zhì)備的混合酶，它含有(yǒu)纖維素酶，果膠酶，澱粉酶，蛋白酶等20多(duō)種酶。适合破碎溶解各種酵母的細胞壁。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

産品介紹：

酵母細胞經Lytic Enzyme處理(lǐ)去除細胞壁後,獨特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞RNA酶，然後用乙醇調節結合條件後,RNA選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟, 去蛋白液和(hé)漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最後低(dī)鹽的RNase free H20将純淨RNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、不需要使用有(yǒu)毒的苯酚,氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

3、快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在20分鍾內(nèi)完成。

4、多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，基本無DNA殘留,可(kě)用于RT-PCR，Northern-blot和(hé)各種實驗。

注意事項

1、第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RB瓶中加入指定量乙醇，加入後請(qǐng)及時(shí)打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

2、所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13，000 rpm的傳統台式離心機。

3、需要自備乙醇，β-巯基乙醇，水(shuǐ)浴鍋。

4、裂解液LBT 和(hé)去蛋白液PRS中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

5、關于DNA 的微量殘留:

一般情況下，一般說來(lái)任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留,本公司的GenePure系列RNA提取産品，由于采取了本公司獨特的緩沖體(tǐ)系和(hé)選擇了特殊吸附能力的吸附膜，在大(dà)多(duō)數(shù)RT-PCR 擴增過程中極其微量的DNA殘留（一般電(diàn)泳EB染色紫外燈下觀察不可(kě)見）影(yǐng)響不是很(hěn)大(dà), 如果要進行(xíng)嚴格的mRNA表達量分析如熒光定量PCR,我們建議在進行(xíng)模闆和(hé)引物的選擇時(shí)：

5. ① 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作(zuò)為(wèi)模闆參與擴增反應。
6. ② 選擇基因組DNA和(hé)cDNA上(shàng)擴增的産物大(dà)小(xiǎo)不一樣的引物對。
7. ③ 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理(lǐ)。本試劑盒還(hái)可(kě)以用于DNase I處理(lǐ)後的RNA清潔(cleanup),請(qǐng)聯系我們索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。
8. ④ 在步驟去蛋白液PRS漂洗前，直接在吸附柱AC上(shàng)進行(xíng)DNase I處理(lǐ)。請(qǐng)聯系我們索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。

6、RNA 純度及濃度檢測:

完整性：RNA 可(kě)用普通(tōng)瓊脂糖凝膠電(diàn)泳 (電(diàn)泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電(diàn)泳緩沖液；150v，15 分鍾)檢測完整性。由于細胞中70%-80%的RNA 為(wèi)rRNA，電(diàn)泳後UV 下應能看到非常明(míng)顯的rRNA 條帶。動物rRNA 大(dà)小(xiǎo)分别約為(wèi)5 kb 和(hé)2kb，分别相當于28S 和(hé)18S rRNA。動物RNA 樣品中最大(dà)rRNA 亮度應為(wèi)次大(dà)rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明(míng)樣品嚴重降解。

純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質污染程度的指标。高(gāo)質量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris, pH7.5）在1.9-2.2 之間(jiān)。OD260/OD280 讀數(shù)受測定所用溶液的pH 值影(yǐng)響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間(jiān)，在水(shuǐ)溶液中所測讀數(shù)則可(kě)能在1.5-1.9 之間(jiān)，但(dàn)這并不表示RNA 不純。

濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水(shuǐ)稀釋n 倍，用RNase-free水(shuǐ)将分光光度計(jì)調零，取稀釋液進行(xíng)OD260, OD280 測定，按照以下公式進行(xíng)RNA濃度的計(jì)算(suàn)：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù)n)×40

操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

1. ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RB瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇!
2. ● 操作(zuò)前在裂解液LBT中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如1 ml LBT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的LBT 4℃可(kě)放置一個(gè)月。
3. ● 吸取使用量的緩沖液BS加入0.2%β-巯基乙醇備用。
4.  

1、小(xiǎo)量酵母培養細胞

1. 1. 收集1ml （約107細胞）處于對數(shù)生(shēng)長期酵母培養物到1.5ml離心管， 12,000 rpm離心30秒(miǎo)，盡可(kě)能吸棄上(shàng)清。
   2. 加入100μl緩沖液BS中（确認已經加入β-巯基乙醇至終濃度0.2%），輕柔吹打充分重懸細胞；根據酵母量加入約20μl Lytic Enzyme儲液，充分颠倒混勻，37℃溫育15－30分鍾消化細胞壁，中間(jiān)可(kě)颠倒數(shù)次幫助消化。   

     如果破壁效果不好導緻産量低(dī)，可(kě)以加大(dà)Lytic Enzyme 用量來(lái)提高(gāo)酶工作(zuò)濃度，還(hái)可(kě)以延長消化時(shí)間(jiān)或者提高(gāo)溫度到45℃來(lái)提高(gāo)效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可(kě)選用其它方法如0.5mm玻璃珠渦旋擊打 ，反複凍融等。

1. 3. 加入380μl裂解液LBT（确認已經加入β-巯基乙醇至終濃度1%），吹打混勻後用手劇(jù)烈振蕩20秒(miǎo)，充分裂解。

一般加入裂解液後充分渦旋吹打後應該見不到明(míng)顯團塊或者不溶物,極少(shǎo)數(shù)情況下如果有(yǒu)明(míng)顯團塊或者不溶物可(kě)以将裂解物13，000rpm離心3分鍾,沉澱不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上(shàng)清全部轉到一個(gè)新離心管再進行(xíng)下一步。

1. 4. 加入280μl 96－100％乙醇，立即吹打混勻，不要離心。
   5. 接操作(zuò)步驟項下3。

2、中量酵母培養細胞

1. 6. 收集2－3ml （約3X107細胞）處于對數(shù)生(shēng)長期酵母培養物到1.5ml離心管（超過1.5ml可(kě)分兩次在同一個(gè)離心管內(nèi)進行(xíng)收集細胞），12，000rpm離心30秒(miǎo)，盡可(kě)能吸棄上(shàng)清。
   7. 加入300μl緩沖液BS中（确認已經加入β-巯基乙醇至終濃度0.2%），輕柔吹打充分重懸細胞；根據酵母量加入50μl Lytic Enzyme儲液，充分颠倒混勻，37℃溫育15－30分鍾消化細胞壁，中間(jiān)可(kě)颠倒數(shù)次幫助消化。

     如果破壁效果不好導緻産量低(dī)，可(kě)以加大(dà)Lytic Enzyme 用量來(lái)提高(gāo)酶工作(zuò)濃度，還(hái)可(kě)以延長消化時(shí)間(jiān)或者提高(gāo)溫度到45℃來(lái)提高(gāo)效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可(kě)選用其它方法如0.5mm玻璃珠渦旋擊打 ，反複凍融等。

1. 8. 13,000 rpm離心1分鍾，盡可(kě)能吸棄上(shàng)清。
   1. 加入350μl裂解液LBT（确認已經加入β-巯基乙醇至終濃度1%），吹打混勻後用手劇(jù)烈振蕩20秒(miǎo)，充分裂解。

 一般加入裂解液後充分渦旋吹打後應該見不到明(míng)顯團塊或者不溶物,極少(shǎo)數(shù)情況下如果有(yǒu)明(míng)顯團塊或者不溶物可(kě)以将裂解物13，000rpm離心3分鍾,沉澱不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上(shàng)清全部轉到一個(gè)新離心管再進行(xíng)下一步。

1. 10. 加入等體(tǐ)積70％乙醇（DEPC水(shuǐ)配制(zhì)，約350μl）立即吹打混勻，不要離心。
   11. 接操作(zuò)步驟項下3。

3、将混合物加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）13,000 rpm離心30-60秒(miǎo)，棄掉廢液。/4加700μl 去蛋白液PRS，室溫放置30秒(miǎo)，12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

如果DNA殘留明(míng)顯,可(kě)在加入PRS後室溫放置5分鍾再離心。

4、加入500μl漂洗液RB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RB,重複一遍。

5、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

6、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水(shuǐ)浴中加熱可(kě)提高(gāo)産量）， 室溫放置1分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。

7、如果預期RNA産量>30μg,加30-50μl RNase free water重複步驟7, 合并兩次洗脫液,或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重複步驟一遍(如果需要RNA濃度高(gāo))。

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高(gāo),分兩次洗脫合并洗脫液的RNA産量比前者高(gāo)15–30%,但(dàn)是濃度要低(dī),用戶根據需要選擇。