1/适用範圍：

适用于快速提取心髒、骨骼肌、血管、氣管、皮膚和(hé)其它纖維豐富的組織RNA。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存6個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項：

1、所有(yǒu)的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低(dī)時(shí)溶液可(kě)能形成沉澱，此時(shí)不應該直接使用，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清。

2、不合适儲存于低(dī)溫（4℃或者－20℃）會(huì)造成溶液沉澱，影(yǐng)響使用效果，因此運輸和(hé)儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行(xíng)。

3、為(wèi)避免降低(dī)活性，方便運輸，提供蛋白酶K為(wèi)凍幹粉狀，收到後，可(kě)短(duǎn)暫離心後，加入0.25ml （20次）和(hé)0.5ml （50次）RNase-free H2O溶解。因為(wèi)反複凍融可(kě)能會(huì)降低(dī)酶活性，因此溶解後可(kě)立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

獨特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞RNA酶，然後用乙醇調節結合條件後,RNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜，再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟, 去蛋白液和(hé)漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最後低(dī)鹽的RNase free H2O将純淨RNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、不需要使用有(yǒu)毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

3、快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在30分鍾內(nèi)完成。

4、多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，基本無DNA殘留,可(kě)用于RT-PCR，Northern-blot和(hé)各種實驗。

6/注意事項：

1、所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

2、需要自備乙醇， β-巯基乙醇，一次性注射器(qì)，研缽，水(shuǐ)浴鍋等。

3、裂解液LBT 和(hé)去蛋白液PRS中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

4、預防RNase 污染，應注意以下幾方面：

1. ① 經常更換新手套。因為(wèi)皮膚經常帶有(yǒu)細菌，可(kě)能導緻RNase 污染。
2. ② 使用無RNase 的塑料制(zhì)品和(hé)槍頭避免交叉污染。
3. ③ RNA 在裂解液LBT 中時(shí)不會(huì)被RNase 降解。但(dàn)提取後繼續處理(lǐ)過程中應使用不含RNase 的塑料和(hé)玻璃器(qì)皿。玻璃器(qì)皿可(kě)在150℃烘烤4 小(xiǎo)時(shí)，塑料器(qì)皿可(kě)在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鍾，然後用水(shuǐ)徹底清洗，再滅菌，即可(kě)去除RNase。
4. ④ 配制(zhì)溶液應使用無RNase 的水(shuǐ)。（将水(shuǐ)加入到幹淨的玻璃瓶中，加入DEPC至終濃度0.1%( v/v)，37℃放置過夜，高(gāo)壓滅菌。）

5、關于DNA 的微量殘留：

一般說來(lái)任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留,本公司的GenePure系列RNA提取産品，由于采取了本公司獨特的緩沖體(tǐ)系和(hé)選擇特殊吸附能力的吸附膜，在大(dà)多(duō)數(shù)RT-PCR 擴增過程中極其微量的DNA殘留（一般電(diàn)泳EB染色紫外燈下觀察不可(kě)見）影(yǐng)響不是很(hěn)大(dà), 如果要進行(xíng)嚴格的mRNA表達量分析如熒光定量PCR,我們建議在進行(xíng)模闆和(hé)引物的選擇時(shí)：

1. ① 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作(zuò)為(wèi)模闆參與擴增反應。
2. ② 選擇基因組DNA和(hé)cDNA上(shàng)擴增的産物大(dà)小(xiǎo)不一樣的引物對。
3. ③ 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理(lǐ)。本試劑盒還(hái)可(kě)以用于DNase I處理(lǐ)後的RNA清潔(cleanup),請(qǐng)聯系我們索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。
4. ④ 在步驟去蛋白液PRS漂洗前，直接在吸附柱AC上(shàng)進行(xíng)DNase I處理(lǐ)。請(qǐng)聯系我們索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。

6、RNA 純度及濃度檢測：

完整性： RNA 可(kě)用普通(tōng)瓊脂糖凝膠電(diàn)泳 (電(diàn)泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電(diàn)泳緩沖液；150v，15 分鍾)檢測完整性。由于細胞中70%-80%的RNA 為(wèi)rRNA，電(diàn)泳後UV 下應能看到非常明(míng)顯的rRNA 條帶。動物rRNA 大(dà)小(xiǎo)分别約為(wèi)5 kb 和(hé)2kb，分别相當于28S 和(hé)18S rRNA。動物RNA 樣品中最大(dà)rRNA 亮度應為(wèi)次大(dà)rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明(míng)樣品嚴重降解。

純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質污染程度的指标。高(gāo)質量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間(jiān)。OD260/OD280 讀數(shù)受測定所用溶液的pH 值影(yǐng)響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間(jiān)，在水(shuǐ)溶液中所測讀數(shù)則可(kě)能在1.5-1.9 之間(jiān)，但(dàn)這并不表示RNA 不純。

濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水(shuǐ)稀釋n 倍，用RNase-free水(shuǐ)将分光光度計(jì)調零，取稀釋液進行(xíng)OD260，OD280 測定，按照以下公式進行(xíng)RNA濃度的計(jì)算(suàn)：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù)n)×40。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

    ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RB瓶和(hé)70%乙醇瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇!

    ● 操作(zuò)前在裂解液LBT中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如1 ml LBT 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的裂解液LBT 4℃可(kě)放置一個(gè)月。

1、分破碎勻漿（非常重要，否則嚴重降低(dī)産量）

1. 1. 電(diàn)動破碎勻漿（首選強烈推薦，産量最高(gāo)結果最穩定）：取約10-20mg（<30mg）新鮮組織，加入300μl裂解液LBT後用電(diàn)動刀片勻漿機（Rotor-Stator如TissueRupter）或者電(diàn)動玻珠研磨機（Bead Mill如TissueLyser）按照機器(qì)使用說明(míng)徹底破碎勻漿組織細胞。
   2. 液氮研磨+勻漿：在液氮中研磨組織成細粉後，取适量組織細粉10-20mg（<30mg）轉入裝有(yǒu)300μl裂解液LBT的1.5ml離心管中, 用手劇(jù)烈振蕩20秒(miǎo)，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器(qì)抽打裂解物 10 次或直到得(de)到滿意勻漿結果(或者電(diàn)動勻漿30秒(miǎo)) ，可(kě)以剪切DNA,降低(dī)粘稠度和(hé)提高(gāo)産量。講勻漿轉入新離心管。
   3. 研缽研磨勻漿： 取适量組織細粉10-20mg（<30mg）放入小(xiǎo)研缽後，迅速加入300μl裂解液LBT後直接室溫充分研磨勻漿。将勻漿轉入新離心管。

注意：如果勻漿沾在研缽內(nèi)損失比較大(dà)，可(kě)以按照比例适當提高(gāo)起始組織用量和(hé)裂解液LBT用量。此外，也可(kě)以先用液氮研磨組織成細粉，然後液氮剛剛蒸發完的時(shí)候加入裂解液LBT充分研磨勻漿，可(kě)以提高(gāo)研磨效果。

2、吸取590μl RNase-free H2O至勻漿中。加入10μl蛋白酶K，移液器(qì)吹打混勻。

3、55℃下水(shuǐ)浴10分鍾。

4、室溫下以13，000rpm離心5分鍾。這樣将會(huì)形成小(xiǎo)量的組織碎片沉澱，而且在上(shàng)清的頂部可(kě)能看見少(shǎo)量的漂浮物。

5、轉移上(shàng)清至一個(gè)新的1.5ml離心管中。

注意：轉移時(shí)不要帶入沉澱物，而且移液槍頭必須放在上(shàng)清漂浮物之下。漂浮物通(tōng)常可(kě)能會(huì)黏附在槍頭的外壁，注意不能将其帶入離心管中。

6、較精确估計(jì)裂解物(上(shàng)清)體(tǐ)積，加入0.5體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇（一般為(wèi)450μl），此時(shí)可(kě)能出現沉澱，但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

7、立刻将混合物(每次小(xiǎo)于700μl，可(kě)以分兩次加入)加入同一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）13,000 rpm離心60秒(miǎo)，棄掉廢液。

8、加700μl 去蛋白液PRS，室溫放置30秒(miǎo)，12，000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

如果DNA殘留明(míng)顯,可(kě)在加入去蛋白液PRS後室溫放置5分鍾再離心。

9、加入500μl漂洗液RB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。加入500μl漂洗液RB，,重複一遍。

10、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

11、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加30-50μl RNase free water（事先在 70-90℃水(shuǐ)浴中加熱可(kě)提高(gāo)産量）， 室溫放置1分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。

12、可(kě)選：使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重複步驟一遍(如果需要RNA濃度高(gāo))。

洗脫兩遍的RNA洗脫液RNA濃度可(kě)以适當提高(gāo)一些(xiē)。如果預期RNA産量>30μg，可(kě)加30-50μl RNase free water重複步驟11，合并兩次洗脫液，可(kě)以提高(gāo)産量15–30%，但(dàn)濃度會(huì)有(yǒu)所降低(dī)。