适用範圍：

适用于快速大(dà)量提取植物組織細胞總RNA。

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存6個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

儲存事項：

1、所有(yǒu)的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低(dī)時(shí)溶液可(kě)能形成沉澱，此時(shí)不應該直接使用，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清。

2、不合适的儲存于低(dī)溫（4℃或者－20℃）會(huì)造成溶液沉澱，影(yǐng)響使用效果，因此運輸和(hé)儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行(xíng)。

3、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

産品介紹：

獨特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞RNA酶，植物RNA助提劑PLA幫助結合多(duō)糖多(duō)酚并通(tōng)過離心去除,然後用乙醇調節結合條件後,RNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜，再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟, 去蛋白液和(hé)漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最後低(dī)鹽的RNase free H20将純淨RNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、不需要使用有(yǒu)毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

3、快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在60分鍾內(nèi)完成。

4、獨有(yǒu)的植物RNA助提劑可(kě)以有(yǒu)效結合多(duō)糖多(duō)酚,提高(gāo)清除效果。

5、多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.9～2.0，基本無DNA殘留,可(kě)用于RT-PCR，Northern-blot和(hé)各種實驗。

注意事項

1、所有(yǒu)的離心步驟均可(kě)在室溫完成，使用可(kě)容納50ml 離心管的離心機。

2、需要自備乙醇，一次性注射器(qì)（可(kě)選），研缽。

3、裂解液LBT 和(hé)去蛋白液PRS中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

4、關于DNA 的微量殘留:

一般說來(lái)任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留,本公司的GenePure系列RNA提取産品，由于采取了本公司獨特的緩沖體(tǐ)系和(hé)選擇了特殊吸附能力的吸附膜，在大(dà)多(duō)數(shù)RT-PCR 擴增過程中極其微量的DNA殘留（一般電(diàn)泳EB染色紫外燈下觀察不可(kě)見）影(yǐng)響不是很(hěn)大(dà), 如果要進行(xíng)嚴格的mRNA表達量分析如熒光定量PCR,我們建議在進行(xíng)模闆和(hé)引物的選擇時(shí)：

4. ① 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作(zuò)為(wèi)模闆參與擴增反應。
5. ② 選擇基因組DNA和(hé)cDNA上(shàng)擴增的産物大(dà)小(xiǎo)不一樣的引物對。
6. ③ 将RNA提取物用RNase-free的DNase I 處理(lǐ)。本試劑盒還(hái)可(kě)以用于DNase I處理(lǐ)後的RNA清潔(cleanup),請(qǐng)聯系我們索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。
7. ④ 在步驟去蛋白液PRS漂洗前，直接在吸附柱AC上(shàng)進行(xíng)DNase I處理(lǐ)。請(qǐng)聯系我們索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。

5、RNA 純度及濃度檢測:

完整性： RNA 可(kě)用普通(tōng)瓊脂糖凝膠電(diàn)泳 (電(diàn)泳條件：膠濃度1.2%；0.5×TBE電(diàn)泳緩沖液；150v，15 分鍾)檢測完整性。由于細胞中70%-80%的RNA 為(wèi)rRNA，電(diàn)泳後UV 下應能看到非常明(míng)顯的rRNA 條帶。動物rRNA 大(dà)小(xiǎo)分别約為(wèi)5 kb 和(hé)2kb，分别相當于28S 和(hé)18S rRNA。動物RNA 樣品中最大(dà)rRNA 亮度應為(wèi)次大(dà)rRNA亮度的1.5-2.0 倍，否則表示RNA 樣品的降解。出現彌散片狀或條帶消失表明(míng)樣品嚴重降解。

純度：OD260/OD280 比值是衡量蛋白質污染程度的指标。高(gāo)質量的RNA，OD260/OD280 讀數(shù)（10mMTris, pH7.5）在1.8-2.1 之間(jiān)。OD260/OD280 讀數(shù)受測定所用溶液的pH 值影(yǐng)響。同一個(gè)RNA 樣品，假定在10mM Tris，pH7.5 溶液中測出的OD260/OD280 讀數(shù)1.8-2.1 之間(jiān)，在水(shuǐ)溶液中所測讀數(shù)則可(kě)能在1.5-1.9 之間(jiān)，但(dàn)這并不表示RNA 不純。

濃度：取一定量的 RNA 提取物，用RNase-free 水(shuǐ)稀釋n 倍，用RNase-free水(shuǐ)将分光光度計(jì)調零，取稀釋液進行(xíng)OD260, OD280 測定，按照以下公式進行(xíng)RNA濃度的計(jì)算(suàn)：終濃度（ng/μl）= (OD260)×(稀釋倍數(shù)n)×40

操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液RB瓶加入指定量無水(shuǐ)乙醇!

1、直接研磨法（推薦）:

a.  新鮮植物組織稱重後取1-2g迅速剪成小(xiǎo)塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可(kě)直接稱重後取1-2g放入研缽）， 加入10體(tǐ)積（10ml）LBT和(hé)1體(tǐ)積（1ml） PLA 室溫下充分研磨成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和(hé)裂解液LBT立刻充分接觸以抑制(zhì)RNA酶活性。

注：PLA是提取多(duō)糖多(duō)酚含量豐富的困難樣品不可(kě)缺少(shǎo)成分。提取普通(tōng)植物組織可(kě)以不加PLA，RNA産量可(kě)能會(huì)提高(gāo)一些(xiē)。

b.  将裂解物轉入離心管，劇(jù)烈搖晃振蕩15秒(miǎo)，10,000-13,000x g離心10分鍾（如果離心機轉速低(dī)，可(kě)适當延長離心時(shí)間(jiān)），沉澱不能裂解的碎片和(hé)結合有(yǒu)多(duō)糖多(duō)酚的PLA，小(xiǎo)心取裂解物上(shàng)清（需計(jì)算(suàn)體(tǐ)積）轉到一個(gè)新離心管。

c.  加入上(shàng)清體(tǐ)積一半的無水(shuǐ)乙醇(0.5體(tǐ)積)，此時(shí)可(kě)能出現沉澱,但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程,立即劇(jù)烈振蕩混勻，不要離心。

d.  立刻接操作(zuò)步驟項下3。

2、液氮研磨法:

a.  取10ml裂解液LBT，轉入50ml離心管中，加入1ml PLA混勻備用。

b.  液氮中研磨适量植物組織成細粉後，取1-2g細粉轉入上(shàng)述裝有(yǒu)LBT和(hé)PLA的離心管, 立即用手劇(jù)烈振蕩20秒(miǎo)，充分裂解。

在56℃溫育1-3分鍾有(yǒu)助于裂解植物,但(dàn)是澱粉含量高(gāo)的植物不能溫育,因為(wèi)提高(gāo)的溫度可(kě)能導緻澱粉膨脹。

c.  用帶鈍針頭的一次性 5ml(配0.9mm針頭) 注射器(qì)抽打裂解物 10 次或直到得(de)到滿意勻漿結果(或者電(diàn)動勻漿30秒(miǎo)),可(kě)以剪切DNA,降低(dī)粘稠度和(hé)提高(gāo)産量。

d.  将裂解物10,000-13,000x g離心10分鍾,沉澱不能裂解的碎片和(hé)結合有(yǒu)多(duō)糖多(duō)酚的PLA，将所有(yǒu)裂解物上(shàng)清轉到一個(gè)新離心管。

e.  較精确估計(jì)裂解物(上(shàng)清)體(tǐ)積，加入0.5體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇,此時(shí)可(kě)能出現沉澱,但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即劇(jù)烈振蕩混勻，不要離心。

f.  立刻接操作(zuò)步驟項下3。

3、将混合物加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）10,000-13,000x g離心5分鍾（确保全部通(tōng)過，膜上(shàng)無殘留液體(tǐ)，否則應加大(dà)轉速和(hé)時(shí)間(jiān)），棄掉廢液。

4、加6ml 去蛋白液PRS，室溫放置1分鍾，12,000x g 離心3分鍾，棄掉廢液。

5、加入10ml漂洗液RB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），10,000-13,000x g離心1-2分鍾，棄掉廢液。加入10ml漂洗液RB，重複一遍。

6、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000x g離心5分鍾以幹燥膜基質殘留乙醇，用槍頭吸除內(nèi)圈壓環和(hé)柱壁之間(jiān)可(kě)能殘留的乙醇，室溫或者烘箱晾幹幾分鍾。 

7、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加500μl -1ml RNase free H2O（事先在 70-90℃水(shuǐ)浴中加熱效果更好）， 室溫放置3分鍾，12,000x g 離心2分鍾。

8、如果預期RNA産量>0.6mg，加300-500μl RNase free H2O重複步驟7，合并兩次洗脫液，或者使用第一次的洗脫液加回到吸附柱重複步驟一遍(如果需要RNA濃度高(gāo))。

洗脫兩遍的RNA洗脫液濃度高(gāo), 分兩次洗脫合并洗脫液的RNA産量比前者高(gāo)15–30%,但(dàn)是濃度要低(dī), 用戶根據需要選擇。