1/适用範圍：

适用于快速從同一個(gè)動物細胞或者組織樣品中同時(shí)提取分離基因組DNA和(hé)包含miRNA的總RNA和(hé)Protein(如購買額外miRNA吸附柱子和(hé)配套溶液，還(hái)可(kě)以将同一個(gè)樣品的總RNA和(hé)miRNA分離并提取，富集miRNA。），不需要使用DNase消化，RNA可(kě)直接用于反轉錄PCR，熒光定量PCR。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項：

1、所有(yǒu)的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低(dī)時(shí)溶液可(kě)能形成沉澱，此時(shí)不應該直接使用，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清。

2、不合适的儲存于低(dī)溫（4℃或者－20℃）會(huì)造成溶液沉澱，影(yǐng)響使用效果，因此運輸和(hé)儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行(xíng)。

3、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

本試劑盒設計(jì)用于快速從同一個(gè)動物細胞或者組織樣品中同時(shí)提取分離基因組DNA和(hé)包括miRNA的總RNA和(hé)Protein。獨特的裂解液迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞RNA/DNA酶，然後裂解混合物RNA/miRNA/ DNA/Protein同時(shí)通(tōng)過一個(gè)基因組DNA吸附柱，基因組DNA被吸附而miRNA/RNA/Protein穿透濾過。DNA吸附柱上(shàng)基因組DNA經過一系列漂洗-離心後洗脫得(de)到純淨基因組DNA。濾過的miRNA/RNA用乙醇調節結合條件後，miRNA/RNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于miRNA/RNA吸附柱上(shàng)， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗-離心洗脫得(de)到純淨的miRNA/RNA。濾液經選擇性沉澱得(de)到Protein。無苯酚、氯仿DNA/RNA快速提取技(jì)術(shù)基礎上(shàng)配合獨家(jiā)的分離技(jì)術(shù)同時(shí)得(de)到的miRNA/RNA/基因組DNA純度高(gāo)，互不幹擾。得(de)到的miRNA/RNA不需要DNase消化，可(kě)直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。基因組DNA也可(kě)以直接用于下遊的Southern、酶切、PCR等各種試驗。

5/産品特點：

1、完全不使用有(yǒu)毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

2、快速，簡捷，單個(gè)樣品miRNA/RNA/基因組DNA/Protein分離操作(zuò)一般可(kě)在1小(xiǎo)時(shí)內(nèi)完成。

3、獨家(jiā)吸附柱和(hé)配方确保有(yǒu)效清除基因組DNA殘留，一般情況下得(de)到的miRNA/RNA不需要DNase消化可(kě)直接用于反轉錄PCR、熒光定量PCR等實驗。

4、多(duō)次柱漂洗确保miRNA/RNA/基因組DNA高(gāo)純度，可(kě)直接用于下遊各種實驗。

6/注意事項：

1、所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

2、樣品處理(lǐ)量絕對不要超過基因組吸附柱CC和(hé)和(hé)RNA吸附柱AC處理(lǐ)能力，否則造成DNA殘留或者産量降低(dī)。不同組織細胞種類RNA/DNA相差極大(dà)，例如胸腺脾髒DNA含量豐富，超過5mg就會(huì)超過柱子處理(lǐ)能力。COS細胞RNA含量豐富，超過3x106細胞就會(huì)超過柱子吸附能力。所以開(kāi)始摸索實驗條件時(shí)，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時(shí)甯可(kě)使用較少(shǎo)的樣品處理(lǐ)量，如細胞不超過3-4x106，組織不超過10mg。将來(lái)根據樣品試驗情況增加或者減少(shǎo)處理(lǐ)量。

3、裂解液LBT Plus 、抑制(zhì)物去除液IR、漂洗液A、漂洗液B中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

4、該試劑盒如需要用于植物樣品尤其是多(duō)糖多(duō)酚次級代謝産物豐富的困難樣品的DNA/miRNA/RNA提取，請(qǐng)咨詢技(jì)術(shù)人(rén)員，可(kě)能需要用到其它試劑。

5、如購買額外miRNA吸附柱子和(hé)配套溶液，還(hái)可(kě)以将同一個(gè)樣品的總RNA和(hé)miRNA分離并提取，富集miRNA。請(qǐng)咨詢我們。

6、關于DNA 的微量殘留：

一般說來(lái)任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做(zuò)到100%無殘留），本公司的Allprep組織/細胞miRNA/DNA/Protein分提試劑盒，由于采取了本公司獨特的緩沖體(tǐ)系和(hé)基因組DNA分離清除技(jì)術(shù)，絕大(dà)多(duō)數(shù)DNA已經被清除，不需要DNase消化，可(kě)直接用于反轉錄PCR和(hé)熒光定量PCR。個(gè)别特殊情況如DNA含量過于豐富造成殘留或者要進行(xíng)嚴格的mRNA表達量分析熒光定量PCR，我們建議在進行(xíng)模闆和(hé)引物的選擇時(shí)：

1. ① 選用跨內(nèi)含子的引物,以穿過mRNA中的連接區(qū),這樣DNA就不能作(zuò)為(wèi)模闆參與擴增反應。
2. ② 選擇基因組DNA和(hé)cDNA上(shàng)擴增的産物大(dà)小(xiǎo)不一樣的引物對。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液A、漂洗液B和(hé)漂洗液WB瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇!

1、組織培養細胞

1. 1. 收集<107懸浮細胞到一個(gè)1.5ml離心管，對于貼壁細胞，孔闆培養可(kě)以直接裂解，細胞瓶培養應該先用胰蛋白酶消化後吹打下來(lái)收集。
   2. 13,000rpm離心10秒(miǎo)（或者300xg離心5分鍾），使細胞沉澱下來(lái)。完全吸棄上(shàng)清，留下細胞團，注意不完全棄上(shàng)清會(huì)稀釋裂解液導緻産量純度降低(dī)。
   3. 輕彈管壁将細胞沉澱完全松散重懸，加350μl（<5x106細胞）或600μl（5x106-1x107細胞）裂解液LBT Plus，吹打混勻後用手劇(jù)烈振蕩20秒(miǎo)充分裂解。
   4. 勻漿：（處理(lǐ)細胞量極少(shǎo)時(shí)<1x105一般不需要，渦旋振蕩一分鍾勻漿）。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器(qì)抽打裂解物 5-10 次或直到得(de)到滿意勻漿結果(或者電(diàn)動勻漿30秒(miǎo)) ，可(kě)以剪切DNA，降低(dī)粘稠度防堵塞柱子和(hé)提高(gāo)産量。
   5. 将裂解混合物或勻漿混合物全部加到DNA吸附柱CC上(shàng)（吸附柱CC放在收集管CT內(nèi)）。
   6. 接操作(zuò)步驟項下3。

2、動物組織（例如鼠肝腦(nǎo)）

1. 1. 電(diàn)動勻漿：新鮮組織用解剖刀迅速切成小(xiǎo)碎塊,加入350μl(<20mg組織)或者600μl(20-30mg組織)的裂解液LBT Plus 後電(diàn)動徹底勻漿20-40秒(miǎo)。
   2. 液氮研磨+勻漿：在液氮中研磨組織成細粉後，取适量組織細粉(20mg/30mg)轉入裝有(yǒu)350μl/600μl組織裂解液LBT Plus的1.5ml離心管中， 用手劇(jù)烈振蕩20秒(miǎo)，充分裂解。用帶鈍針頭的一次性 1 ml(配0.9mm針頭) 注射器(qì)抽打裂解物 10 次或直到得(de)到滿意勻漿結果(或者電(diàn)動勻漿30秒(miǎo)) ，可(kě)以剪切DNA，降低(dī)粘稠度防堵塞柱子和(hé)提高(gāo)産量。
   3. 将勻漿後裂解物13,000rpm離心3分鍾,沉澱可(kě)能存在的裂解困難的碎片或者不溶物，将裂解物上(shàng)清全部加到DNA吸附柱CC上(shàng)（吸附柱CC放在收集管CT內(nèi)）。
   4. 接操作(zuò)步驟項下3。

3、13,000 rpm離心30秒(miǎo)，保留濾過液（miRNA/RNA/Protein在濾過液中）。DNA吸附柱子（膜上(shàng)吸附有(yǒu)基因組DNA）短(duǎn)時(shí)間(jiān)可(kě)存放4℃度備用。

确保離心後液體(tǐ)全部濾過去，膜上(shàng)沒有(yǒu)殘留，如有(yǒu)必要，可(kě)以加大(dà)離心力和(hé)離心時(shí)間(jiān)。

以下步驟為(wèi)提取RNA步驟：

4、用微量移液器(qì)較精确估計(jì)濾過液體(tǐ)積（350μl或者600μl左右，濾過時(shí)候損失體(tǐ)積應該減去），加入1.25倍體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇，此時(shí)可(kě)能出現沉澱,但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

5、立刻将混合物(每次小(xiǎo)于700μl，多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入一個(gè)RNA吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）13,000 rpm離心30秒(miǎo)，保留濾過液以備提取Protein。

濾過液含有(yǒu)Protein，請(qǐng)轉入一個(gè)合适大(dà)小(xiǎo)（至少(shǎo)2倍濾過液體(tǐ)積）的離心管，保留被用于步驟17開(kāi)始的Protein提取。裝濾過液體(tǐ)和(hé)乙醇混合物的DNA吸附柱的收集管CT（混合物轉入RNA吸附柱後剩下的空(kōng)收集管CT）需要保留，将DNA吸附柱放回此收集管CT保留在4℃，備用于步驟11開(kāi)始的基因組DNA提取。

5、加700μl 漂洗液A（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

6、加入500μl 漂洗液B（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。加入500μl 漂洗液B，重複一遍。

7、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

8、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加30-50μl RNase free water， 室溫放置1分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。

9、如得(de)到的RNA可(kě)以立即用于下遊反應或者盡快置于低(dī)溫保存。

以下步驟為(wèi)提取DNA步驟：

11、在步驟3的DNA吸附柱上(shàng)加入500μl抑制(zhì)物去除液IR，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄廢液。

12、加入700μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

13、加入500μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

14、将DNA吸附柱放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

15、取出DNA吸附柱，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加100μl洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70℃水(shuǐ)浴中預熱效果更好）， 室溫放置3-5分鍾，12,000rpm 離心1分鍾。将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鍾，12,000rpm離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要DNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于50μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)DNA洗脫效率，減少(shǎo)DNA産量。

16、DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。

以下步驟為(wèi)提取Protein步驟：

17、将步驟5的濾過液中加入等體(tǐ)積的緩沖液APP，渦旋振蕩混勻，室溫放置15分鍾沉澱Protein。

18、13,000rpm離心5-10分鍾，小(xiǎo)心棄上(shàng)清。加入0.5ml 70%乙醇，颠倒後離心1分鍾，小(xiǎo)心棄上(shàng)清，留下蛋白沉澱，盡量将殘留液體(tǐ)用移液器(qì)吸幹淨。

19、室溫晾幹沉澱5-10分鍾，注意一定讓乙醇揮發幹淨，以免下遊試驗受影(yǐng)響。

20、将蛋白沉澱溶解于30-150μl 1x 蛋白上(shàng)樣緩沖液（如需要蛋白定量，緩沖液中不應該加入溴酚蘭）或其它下遊試驗要求的緩沖液中。

由于裂解液LBT Plus強變性作(zuò)用或者不同蛋白等電(diàn)點，蛋白可(kě)能溶解比較困難，用移液器(qì)吹打幫助溶解或者改變PH值幫助蛋白溶解，短(duǎn)暫離心取上(shàng)清使用。或者用5% SDS或者8M 尿素幫助溶解蛋白沉澱後做(zuò)蛋白定量。注意如果需要BCA蛋白定量可(kě)能需要把8M尿素稀釋到3M。

21、95℃放置5分鍾溶解和(hé)變性蛋白，回複到室溫，最高(gāo)速離心1分鍾，取上(shàng)清進行(xíng)SDS-PAGE電(diàn)泳或者western blot 等試驗。