1/适用範圍：

适用于快速提取植物microRNA或者microRNA/總RNA分别提取。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存6個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項：

1、所有(yǒu)的溶液應該是澄清的，如果環境溫度低(dī)時(shí)溶液可(kě)能形成沉澱，此時(shí)不應該直接使用，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清。

2、不合适的儲存于低(dī)溫（4℃或者－20℃）會(huì)造成溶液沉澱，影(yǐng)響使用效果，因此運輸和(hé)儲存均在室溫下（15℃－25℃）進行(xíng)。

3、漂洗液B可(kě)能加入乙醇使用幾天後出現沉澱晶體(tǐ)，并不影(yǐng)響使用，直接不吸晶體(tǐ)，吸上(shàng)清使用就可(kě)以。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、PH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

傳統的microRNA提取試劑盒均是采用異硫氰酸胍/苯酚/氯仿（TRIzol法）加高(gāo)濃度乙醇矽膠膜吸附小(xiǎo)片段microRNA的原理(lǐ)方法制(zhì)成，但(dàn)是複雜的植物品類如棉花(huā)、葡萄、胡楊、冬青、月季、石斛、單參、水(shuǐ)稻種子、人(rén)參、玉米胚芽等大(dà)量樣品用TRIzol的原理(lǐ)甚至無法提取符合要求的總RNA，更不用說microRNA。因此很(hěn)多(duō)世界著名公司采用Trizol法原理(lǐ)的microRNA提取試劑盒面臨複雜植物樣品時(shí)束手無策，産品線中幹脆就沒有(yǒu)複雜植物microRNA提取試劑盒。用戶萬般無奈隻好用傳統方法，或者TRIzol法提取，用異丙醇/乙醇沉澱方法來(lái)提取microRNA，雖然也能提取到部分microRNA，但(dàn)是沉澱法損失巨大(dà)或者和(hé)雜質共沉澱，影(yǐng)響實驗結果，在國際刊物投稿時(shí)常常面臨質疑，甚至論文被撤銷。而本試劑盒在公司全球領先數(shù)百種複雜植物提取的經驗基礎上(shàng)，創新性的不用苯酚，氯仿的技(jì)術(shù)路線全球首家(jiā)解決該問題，可(kě)以提取絕大(dà)多(duō)數(shù)複雜植物如棉花(huā)、楊樹(shù)、冬青、月季、丹參、煙草等植物microRNA。

獨特的裂解液迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞RNA酶，植物RNA助提劑PLA幫助結合多(duō)糖多(duō)酚并通(tōng)過離心去除，然後裂解混合物通(tōng)過基因組DNA清除柱CC，基因組DNA被清除而RNA（包括microRNA）被選擇性濾過。濾過的RNA用乙醇調節結合條件後，RNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜，再通(tōng)過一系列特殊漂洗液快速的漂洗－離心的步驟,将細胞代謝物，蛋白等雜質去除，最後低(dī)鹽的RNase free H20将純淨RNA（包括microRNA）從矽基質膜上(shàng)洗脫。

采用分提取操作(zuò)步驟也可(kě)單獨純化富集後的microRNA組分和(hé)總RNA（>200 nt）從而得(de)到分離富集的microRNA和(hé)RNA。

5/産品特點：

1、完全不使用有(yǒu)毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

2、快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在30分鍾內(nèi)完成。

3、獨有(yǒu)的植物RNA助提劑可(kě)以有(yǒu)效結合多(duō)糖多(duō)酚,提高(gāo)清除效果。

4、多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達2.0～2.2，可(kě)用于RT-PCR，Northern-blot和(hé)各種實驗。

6/注意事項

1、所有(yǒu)的離心步驟均可(kě)在室溫完成（或4℃離心也可(kě)以），使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

2、需要自備乙醇，β-巯基乙醇，研缽(可(kě)選)。

3、樣品處理(lǐ)量絕對不要超過基因組清除柱CC和(hé)和(hé)RNA吸附柱AC處理(lǐ)能力，否則造成DNA殘留或産量降低(dī)。開(kāi)始摸索實驗條件時(shí)，如果不清楚樣品DNA/RNA含量時(shí)可(kě)使用較少(shǎo)的樣品處理(lǐ)量，将來(lái)根據樣品試驗情況增加或者減少(shǎo)處理(lǐ)量。

4、裂解液LBT Plus和(hé)漂洗液A中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。 

5、關于DNA 的微量殘留：

一般說來(lái)任何總RNA提取試劑在提取過程中無法完全避免DNA的微量殘留（DNase消化也無法做(zuò)到100%無殘留），該産品由于采取了本公司獨特的緩沖體(tǐ)系和(hé)基因組DNA清除柱技(jì)術(shù)，絕大(dà)多(duō)數(shù)DNA已經被清除，個(gè)别特殊情況需要清除微量基因組DNA殘留，可(kě)使用以下幾種DNA酶消化的方式。

5. ① 傳統DNA酶消化提取的RNA/microRNA，熱滅活DNA酶後直接用于後續實驗。
6. ② 傳統DNA酶消化提取的RNA/microRNA，然後使用RNA清潔純化試劑盒（貨号：RE132，但(dàn)是需要将說明(míng)書(shū)改動一個(gè)地方，第二步加入250μl無水(shuǐ)乙醇改成加入700μl無水(shuǐ)乙醇)清潔純化後用于後續實驗。
7. ③ 直接在吸附柱AC上(shàng)進行(xíng)DNase I柱上(shàng)消化處理(lǐ)。購買DNA酶柱上(shàng)消化試劑盒(貨号：RE128，但(dàn)是需将說明(míng)書(shū)的去蛋白液PRS改成漂洗液A) 可(kě)先索取具體(tǐ)操作(zuò)說明(míng)書(shū)。

6、碰到特别複雜多(duō)糖多(duō)酚，澱粉等次級代謝産物特别豐富的樣品，如葡萄果實，水(shuǐ)稻種子，裂解液LBT Plus效果不佳的情況下，應該購買專用裂解液CLB。裂解液CLB是本公司為(wèi)特别複雜的多(duō)糖多(duō)酚植物樣品研發的最強配方，絕大(dà)部分裂解液LBT Plus無法提取的複雜樣品都可(kě)以提取成功。見附錄3。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

     ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液A和(hé)漂洗液B瓶加入指定量無水(shuǐ)乙醇!

     ● 對于RNA酶或者多(duō)酚特别豐富植物組織：操作(zuò)前在裂解液LBT Plus中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如1 ml LBT Plus 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的LBT Plus 4℃可(kě)放置一個(gè)月。

1、直接研磨法（提取簡單植物樣品推薦此法，但(dàn)是簡單樣品也可(kě)以用液氮研磨法）:

a.  新鮮植物組織稱重後取100mg迅速剪成小(xiǎo)塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可(kě)直接稱重後取100mg放入研缽）， 加入10體(tǐ)積（1ml）LBT Plus和(hé)1體(tǐ)積（100μl） PLA 室溫下充分研磨成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和(hé)裂解液LBT Plus立刻充分接觸以抑制(zhì)RNA酶活性。

注：PLA是提取多(duō)糖多(duō)酚次級代謝産物色素含量豐富的困難樣品不可(kě)缺少(shǎo)成分。

b.  将裂解物轉入離心管，劇(jù)烈搖晃振蕩15秒(miǎo)，13，000rpm離心5-10分鍾,沉澱不能裂解的碎片和(hé)結合有(yǒu)多(duō)糖多(duō)酚的PLA。

c. 取480μl裂解物上(shàng)清（在不超過基因組DNA清除柱CC能力的情況下可(kě)以取更多(duō)的上(shàng)清，這樣可(kě)以提高(gāo)産量，如殘留基因組DNA較多(duō)，可(kě)适當減少(shǎo)取上(shàng)清量）将裂解物上(shàng)清加到DNA清除柱CC上(shàng)（清除柱CC放在收集管CT內(nèi)）。

d.  立刻接操作(zuò)步驟的步驟3。

2、液氮研磨法（提取複雜，易降解樣品時(shí)推薦此法）:

a.  取500μl裂解液LBT Plus，轉入1.5ml離心管中，加50μl PLA混勻備用。

b.  液氮中研磨适量植物組織成細粉後，取50mg細粉轉入上(shàng)述裝有(yǒu)LBT Plus和(hé)PLA的離心管, 立即用手劇(jù)烈振蕩20秒(miǎo)，充分裂解。

c.  用吸頭吹打混勻幫助裂解或者劇(jù)烈渦旋震蕩直到得(de)到滿意勻漿結果(或者電(diàn)動勻漿30秒(miǎo))，可(kě)以剪切DNA，降低(dī)粘稠度和(hé)提高(gāo)産量。

d.  将裂解物13,000 rpm離心5-10分鍾，沉澱不能裂解的碎片和(hé)結合有(yǒu)多(duō)糖多(duō)酚的PLA。

e.  取裂解物上(shàng)清（在不超過基因組DNA清除柱CC能力的情況下可(kě)以取更多(duō)的上(shàng)清，這樣可(kě)以提高(gāo)産量）将裂解物上(shàng)清加到DNA清除柱CC上(shàng)（清除柱CC放在收集管CT內(nèi)）。

f.  立刻接操作(zuò)步驟的步驟3。

注意：以上(shàng)液氮研磨法用戶可(kě)以根據需要加倍處理(lǐ)，可(kě)以提高(gāo)産量。也就是使用1ml的裂解液LBT Plus和(hé)100μl PLA和(hé)100mg的樣品。

3、立即13,000 rpm離心60秒(miǎo)，收集濾液（RNA在濾液中）。

4、用微量移液器(qì)較精确估計(jì)濾過液體(tǐ)積（480μl左右，濾過時(shí)候損失體(tǐ)積應該減去），加入1.25倍體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇，此時(shí)可(kě)能出現沉澱，但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即吹打混勻，不要離心。

5、立刻将混合物(每次小(xiǎo)于700μl，多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱AC放入收集管CT中）13,000 rpm離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

确保離心後液體(tǐ)全部濾過去，膜上(shàng)沒有(yǒu)殘留，如有(yǒu)必要，可(kě)以加大(dà)離心力和(hé)離心時(shí)間(jiān)。

6、加700μl 漂洗液A（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

7、加入500μl 漂洗液B（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。加入500μl 漂洗液B，重複一遍。

8、将吸附柱AC放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液, 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

9、取出吸附柱AC，放入一個(gè)RNase free離心管中，根據預期RNA産量在吸附膜的中間(jiān)部位加30-50μl RNase free water， 室溫放置1分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。

将洗脫液加回到吸附柱重複洗脫步驟一遍可(kě)以提高(gāo)産量約10-15%。

10、得(de)到的RNA/microRNA可(kě)以立即用于下遊反應或者盡快置于低(dī)溫保存。

8/附錄1：microRNA富集方法（microRNA/去除了microRNA的總RNA分别提取）

提示：

     ● 對于RNA酶或者多(duō)酚特别豐富植物組織：操作(zuò)前在裂解液LBT Plus中加入β-巯基乙醇至終濃度1%，如1 ml LBT Plus 中加入10μl β-巯基乙醇。此裂解液最好現用現配。配好的LBT Plus 4℃可(kě)放置一個(gè)月。

1、直接研磨法（提取簡單植物樣品推薦此法，但(dàn)是簡單樣品也可(kě)以用液氮研磨法）:

a.  新鮮植物組織稱重後取100mg迅速剪成小(xiǎo)塊放入研缽（冰凍保存或者液氮保存樣品可(kě)直接稱重後取100mg放入研缽），加入10體(tǐ)積（1ml）LBT Plus和(hé)1體(tǐ)積（100μl） PLA 室溫下充分研磨成勻漿，注意應該迅速研磨讓組織和(hé)裂解液RLT立刻充分接觸以抑制(zhì)RNA酶活性。

注：PLA是提取多(duō)糖多(duō)酚次級代謝産物色素含量豐富的困難樣品不可(kě)缺少(shǎo)成分。

b.  将裂解物轉入離心管，劇(jù)烈搖晃振蕩15秒(miǎo)，13,000rpm離心5-10分鍾,沉澱不能裂解的碎片和(hé)結合有(yǒu)多(duō)糖多(duō)酚的PLA。

c.  取480μl裂解物上(shàng)清（在不超過基因組DNA清除柱CC能力的情況下可(kě)以取更多(duō)的上(shàng)清，這樣可(kě)以提高(gāo)産量，如殘留基因組DNA較多(duō)，可(kě)适當減少(shǎo)取上(shàng)清量）轉到一個(gè)新離心管。加入上(shàng)清體(tǐ)積一半的無水(shuǐ)乙醇(0.5體(tǐ)積)，此時(shí)可(kě)能出現沉澱,但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程,立即吹打混勻,不要離心。

d.  立刻接富集方法的步驟3。

2、液氮研磨法（提取複雜，易降解樣品時(shí)推薦此法）:

a.  取500μl裂解液LBT Plus，轉入1.5ml離心管中，加50μl PLA混勻備用。

b.  液氮中研磨适量植物組織成細粉後，取50mg細粉轉入上(shàng)述裝有(yǒu)LBT Plus和(hé)PLA的離心管, 立即用手劇(jù)烈振蕩20秒(miǎo)，充分裂解。

c.  用吸頭吹打混勻幫助裂解或者劇(jù)烈渦旋震蕩直到得(de)到滿意勻漿結果(或者電(diàn)動勻漿30秒(miǎo))，可(kě)以剪切DNA，降低(dī)粘稠度和(hé)提高(gāo)産量。

d.  将裂解物13,000 rpm離心5-10分鍾，沉澱不能裂解的碎片和(hé)結合有(yǒu)多(duō)糖多(duō)酚的PLA。

e.  取裂解物上(shàng)清（在不超過基因組DNA清除柱CC能力的情況下可(kě)以取更多(duō)的上(shàng)清，這樣可(kě)以提高(gāo)産量）轉到一個(gè)新離心管。加入上(shàng)清體(tǐ)積一半的無水(shuǐ)乙醇(0.5體(tǐ)積)，此時(shí)可(kě)能出現沉澱,但(dàn)是不影(yǐng)響提取過程，立即吹打混勻,不要離心。

f.  立刻接富集方法的步驟3。

注意：以上(shàng)液氮研磨法用戶可(kě)以根據需要加倍處理(lǐ)，可(kě)以提高(gāo)産量。也就是使用1ml的裂解液LBT Plus和(hé)100μl PLA和(hé)100mg的樣品。

3、将混合物(每次小(xiǎo)于720μl，多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入一個(gè)基因組清除柱CC中，（清除柱CC放入收集管CT中）13,000 rpm離心2分鍾，保留濾液（microRNA在濾液中）。

此時(shí)，濾過液含有(yǒu)microRNA，基因組DNA清除柱CC上(shàng)面是去除了microRNA的總RNA（不包含microRNA），如果需要，可(kě)以按照前面标準操作(zuò)步驟6－10操作(zuò)漂洗，洗脫回收得(de)到去除了microRNA的總RNA。

4、用微量移液器(qì)較精确估計(jì)濾過液體(tǐ)積，加入0.65倍體(tǐ)積無水(shuǐ)乙醇（必須是室溫的），渦旋或者吹打充分混勻，不要離心。

5、立刻将混合物(每次小(xiǎo)于700μl，多(duō)可(kě)以分兩次加入)加入一個(gè)吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管CT中）13,000 rpm離心2分鍾，棄掉廢液。

确保離心後液體(tǐ)全部濾過去，膜上(shàng)沒有(yǒu)殘留，如有(yǒu)必要，可(kě)以加大(dà)離心力和(hé)離心時(shí)間(jiān)。

6、按照前面标準操作(zuò)步驟6－10操作(zuò)漂洗，洗脫得(de)到富集的microRNA。

注意：不同的實驗可(kě)以選擇不同的方法，例如Northern Blot或者表達芯片譜分析可(kě)以選擇提取包括microRNA的總RNA。富集方法提取的microRNA因為(wèi)去除了較大(dà)片段的mRNA和(hé)rRNA等，可(kě)能減少(shǎo)某些(xiē)下遊試驗的擴增背景，當背景較高(gāo)或者非特異擴增較多(duō)時(shí)，可(kě)以嘗試使用富集方法提取的microRNA。 

9/附錄2：DNA酶柱上(shàng)消化（詳細請(qǐng)參考DNase I 柱上(shàng)消化試劑盒說明(míng)書(shū))

1、按照前面所列操作(zuò)步驟操作(zuò)，直到做(zuò)完操作(zuò)步驟5。

2、取45μl DNase I buffer和(hé)5μl RNase free DNase I在離心管輕輕吹打混勻成工作(zuò)液（處理(lǐ)多(duō)個(gè)離心柱子要按照比例放大(dà)制(zhì)備工作(zuò)液）。

3、向吸附柱AC 中加入350μl 漂洗液A，12,000 rpm 離心30 秒(miǎo)，棄廢液，将吸附柱放回收集管CT中。

4、向吸附柱AC 中央加入50μl的DNase I 工作(zuò)液，室溫（20℃-30℃）放置15分鍾。注意直接将工作(zuò)液滴在膜中央上(shàng)向膜四周浸潤充分和(hé)膜接觸，不要讓工作(zuò)液滴在O型墊圈或是離心柱管壁上(shàng)挂壁或者挂在墊圈上(shàng)不能充分和(hé)膜接觸。

5、向吸附柱AC 中加入350μl 漂洗液A，12,000 rpm 離心30-60 秒(miǎo)，棄廢液，将吸附柱放回收集管CT中。

6、接操作(zuò)步驟7完成後續步驟。

10/附錄3：使用裂解液CLB

提示：

     ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液A和(hé)漂洗液B瓶加入指定量無水(shuǐ)乙醇!

     ● 取1ml裂解液 CLB至離心管內(nèi)(如果CLB有(yǒu)析出或者沉澱需先置于65°C水(shuǐ)浴重新溶解）， 在裂解液CLB中加入5%ß-巯基乙醇（1ml CLB加50μl ß-巯基乙醇）。颠倒混勻後65°C水(shuǐ)浴中預熱。

1、液氮中研磨新鮮或-70°C冷凍的材料至細粉。

2、轉移100-150mg細粉（水(shuǐ)分少(shǎo)的樣品如種子葉片等可(kě)加100mg，水(shuǐ)分多(duō)的樣品如西瓜可(kě)多(duō)加一些(xiē)）加至預熱的裂解液CLB（已加有(yǒu)ß-巯基乙醇）離心管中，立即激烈渦旋30－60秒(miǎo)或者用吸頭吹打混勻裂解，短(duǎn)時(shí)放回 65°C水(shuǐ)浴中（5 min-10 min，時(shí)間(jiān)稍長一點10分鍾産量可(kě)能提高(gāo)一些(xiē)），中間(jiān)偶爾颠倒1-2次幫助裂解。

ß-巯基乙醇是裂解液CLB的關鍵成分，必要的時(shí)候可(kě)以提高(gāo)終濃度到10-20%。

3、振蕩混勻後室溫13,000rpm離心10分鍾。

4、取裂解物上(shàng)清（在不超過基因組DNA清除柱CC能力的情況下可(kě)以取更多(duō)的上(shàng)清，這樣可(kě)以提高(gāo)産量）轉到一個(gè)新離心管。

若上(shàng)清表面有(yǒu)漂浮物，用吸頭挑開(kāi)吸取下面液體(tǐ)即可(kě)。

5、立刻接後續操作(zuò)步驟。