目錄号：PE103

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

內(nèi)毒素清除劑ER常溫運輸，4度可(kě)以保存一個(gè)月，長期保存放-20℃。

儲存事項:

1、第一次使用時(shí)，将試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液A後（終濃度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果溶液A中RNase A失活，提取的質粒可(kě)能會(huì)有(yǒu)微量RNA殘留，在溶液A中補加RNase A即可(kě)。

2、環境溫度低(dī)時(shí)溶液B中SDS可(kě)能會(huì)析出渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

産品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，通(tōng)過獨特的內(nèi)毒素清除劑ER選擇性結合離心除去內(nèi)毒素，然後離心吸附柱內(nèi)的矽基質膜在高(gāo)鹽、低(dī)pH值狀态下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通(tōng)過去蛋白液和(hé)漂洗液将雜質和(hé)其它細菌成分去除，最後低(dī)鹽、高(gāo)pH值的洗脫緩沖液将純淨質粒DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、獨特工藝配方清除內(nèi)毒素，內(nèi)毒素含量極低(dī)（<0.1 EU/μg DNA），細胞轉染效果極佳。也可(kě)直接用于酶切、轉化、PCR、體(tǐ)外轉錄、測序、等各種分子生(shēng)物學實驗。

注意事項

1、所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的傳統台式離心機。

2、提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有(yǒu)關。一般高(gāo)拷貝質粒，建議接種單菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生(shēng)素的LB培養基， 過夜培養14-16個(gè)小(xiǎo)時(shí)，可(kě)提取出多(duō)達20µg的純淨質粒。如果所提質粒為(wèi)低(dī)拷貝質粒或大(dà)于10kb的大(dà)質粒，應适當加大(dà)菌體(tǐ)使用量，使用5-10 ml過夜培養物，同時(shí)按比例增加A、B、D的用量，其它步驟相同。

3、得(de)到的質粒DNA可(kě)用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和(hé)紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD260值為(wèi)1相當于大(dà)約50μg/ml DNA。電(diàn)泳可(kě)能為(wèi)單一條帶，也可(kě)能為(wèi)2條或者多(duō)條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時(shí)間(jiān)長短(duǎn)、提取時(shí)操作(zuò)劇(jù)烈程度等有(yǒu)關。本公司産品正常操作(zuò)情況下基本超螺旋可(kě)以超過90%。

4、質粒DNA确切分子大(dà)小(xiǎo)， 必須酶切線性化後，對比DNA分子量Marker才可(kě)以知道(dào)。處于環狀或者超螺旋狀态的的質粒，泳動位置不确定，無法通(tōng)過電(diàn)泳知道(dào)其确切大(dà)小(xiǎo)。

5、洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA，不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫，但(dàn)應該确保pH大(dà)于7.5，pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫質粒應該保存在－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

關于平衡液BS的使用

介紹：核酸吸附矽膠膜柱子長期放置過程中會(huì)同空(kōng)氣中的電(diàn)荷/塵埃發生(shēng)反應而影(yǐng)響其核酸的結合能力。矽膠柱經平衡液BS預處理(lǐ)後可(kě)大(dà)大(dà)減少(shǎo)柱子中矽膠膜的憎水(shuǐ)基團，提高(gāo)核酸的結合能力。從而提高(gāo)矽膠柱子回收效率或者産量。平衡液BS是強堿性溶液，若不小(xiǎo)心碰到，請(qǐng)用大(dà)量自來(lái)水(shuǐ)清洗。用完後需蓋緊瓶蓋，以免接觸空(kōng)氣。室溫保存。在保存過程中可(kě)能有(yǒu)沉澱生(shēng)成，請(qǐng)加熱至37℃使沉澱完全消失。

使用方法：取一個(gè)新的矽膠膜吸附柱裝在收集管CT中，吸取100μl的平衡液BS至柱子中。13000 rpm離心1分鍾，倒掉收集管CT中廢液，将吸附柱子重新放回收集管CT。此時(shí)平衡液BS預處理(lǐ)柱子完畢。接後續的操作(zuò)步驟。

操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

     ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

     ● 将RNase A全部加入溶液A中，混勻，每次使用後置于2-8℃保存。

1、取1.5-4.5 ml過夜培養的菌液，12,000rpm離心30秒(miǎo)，盡可(kě)能的倒幹上(shàng)清，收集菌體(tǐ)。

收集超過1.5 ml菌液， 可(kě)以離心棄上(shàng)清後，在同一個(gè)1.5ml管內(nèi)加入更多(duō)的菌液，重複步驟1，直到收集到足夠的菌體(tǐ)。

2、用250μl溶液A重懸菌體(tǐ)沉澱，渦旋振蕩至徹底懸浮。  

如果有(yǒu)未徹底混勻的菌塊，會(huì)影(yǐng)響裂解，導緻提取量和(hé)純度偏低(dī)。

3、加250μl的溶液B，溫和(hé)地上(shàng)下翻轉6 -8次使菌體(tǐ)充分裂解，室溫放置4分鍾。

溫和(hé)地混合，不要劇(jù)烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時(shí)間(jiān)不應超過5分鍾！以免質粒受到破壞。此時(shí)菌液應變得(de)清亮粘稠，如果菌體(tǐ)少(shǎo)，很(hěn)快清亮粘稠後就可(kě)以做(zuò)下一步，不是一定要準确的5分鍾。

4、加250μl溶液D，立即溫和(hé)地上(shàng)下翻轉6 -8次，充分混勻時(shí)會(huì)出現白色絮狀沉澱。13,000rpm離心10分鍾，小(xiǎo)心取上(shàng)清至新管，避免吸取到漂浮白色沉澱。

加入溶液D後應該立即混勻，以免産生(shēng)SDS的局部沉澱。

5、加入0.1體(tǐ)積(上(shàng)清的體(tǐ)積的10%，約80µl)的內(nèi)毒素清除劑ER到上(shàng)一步所得(de)上(shàng)清，颠倒旋轉混勻，冰浴或者插入碎冰中(或冰箱冷凍室)放置5分鍾直到渾濁變清亮透明(míng)（或仍舊(jiù)稍有(yǒu)渾濁），中間(jiān)偶爾混勻幾次。

內(nèi)毒素清除劑ER加入上(shàng)清後，上(shàng)清會(huì)變得(de)渾濁，但(dàn)是冰浴後應恢複清亮（或稍渾濁）。

6、常溫放置3-5分鍾，溫度恢複室溫溶液很(hěn)快變為(wèi)渾濁，颠倒混勻。

如室內(nèi)溫度較低(dī)或者想加快速度可(kě)以在37-42℃水(shuǐ)浴，将很(hěn)快變渾濁，颠倒混勻。

7、室溫14,000 x g離心10 分鍾分相 。上(shàng)層水(shuǐ)相含DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和(hé)其它雜質。将含DNA的上(shàng)層水(shuǐ)相轉移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層，裏面含內(nèi)毒素等雜質），棄油狀層。

平衡液BS預處理(lǐ)吸附柱：

使用平衡液BS預處理(lǐ)矽膠膜吸附柱為(wèi)必做(zuò)步驟，具體(tǐ)方法參見前文“關于平衡液BS的使用”

8、向上(shàng)層水(shuǐ)相中加入0.5體(tǐ)積異丙醇（約370µl）後充分颠倒混勻後分兩次（每次不超過700µl）轉入吸附柱AD中（吸附柱AD放入收集管CT中），12,000 x g離心1分鍾，倒掉收集管CT中的廢液。直到所有(yǒu)混合溶液通(tōng)過此吸附柱。

9、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。再加入600μl漂洗液WB，重複漂洗一次。

10、将吸附柱AD放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

11、取出吸附柱AD，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加50-100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中加熱效果更好），室溫放置2分鍾，12,000rpm 離心1分鍾。如果需要較多(duō)量質粒，可(kě)将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鍾，離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)。如果需要質粒濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于30μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)質粒洗脫效率，減少(shǎo)質粒産量。