目錄号：PE113

适用範圍：

适用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大(dà)型質粒制(zhì)備。

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

儲存事項:

1、第一次使用時(shí)，将試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液A後（終濃度100μg /ml）置于4℃保存。如果溶液A中RNase A失活，提取的質粒可(kě)能會(huì)混雜有(yǒu)微量RNA殘留，在溶液A中補加RNase A即可(kě)。

2、內(nèi)毒素清除劑ER在4℃可(kě)保存一個(gè)月，如果要長期保存，建議保存在－20℃!

3、環境溫度低(dī)時(shí)溶液B中SDS可(kě)能會(huì)析出出現渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

4、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

産品介紹：

常規的離心柱型質粒抽提試劑盒并不适用于BAC/PAC/P1/Cosmid等大(dà)型質粒DNA的抽提。這主要是因為(wèi)大(dà)型質粒DNA分子量很(hěn)大(dà)，常常會(huì)超過100kb而且一般拷貝數(shù)低(dī)産量低(dī)，使用常規的離心柱吸附膜吸附效率和(hé)産量很(hěn)低(dī)而且過膜會(huì)打斷這些(xiē)大(dà)分子量的質粒DNA。本試劑盒采用改進堿裂解法從培養菌中提取質粒DNA，采用獨特的溶液配方和(hé)內(nèi)毒素清除試劑，隻需要幾次簡單離心去除蛋白質、多(duō)糖、內(nèi)毒素、RNA等雜質，獲得(de)高(gāo)質量的質粒DNA。純化DNA的OD260/280通(tōng)常在1.8左右，得(de)到的質粒可(kě)直接應用于細胞轉染甚至動物體(tǐ)內(nèi)實驗等對DNA純度要求很(hěn)高(gāo)的工作(zuò)中。純化後期過程均在1.5ml離心管中操作(zuò)，方法簡單，不需特殊設備，無需過柱，不用酚氯仿抽提；基本可(kě)完全回收細菌裂解釋放出的質粒，不必擔心質粒DNA的丢失。本方法提取純化質粒DNA，對質粒損傷小(xiǎo)，即使是100kb甚至200kb以上(shàng)的大(dà)型質粒或超大(dà)型BAC/PAC質粒，隻要堿裂解法能夠提取，就可(kě)以有(yǒu)效純化。此外溶液型的試劑可(kě)以按照比例放大(dà)縮小(xiǎo)進行(xíng)小(xiǎo)提/中提/大(dà)提，最後可(kě)選擇任意小(xiǎo)體(tǐ)積溶解質粒，濃度可(kě)高(gāo)達3μg/μl。

産品特點：

1、不需要使用有(yǒu)毒的苯酚，氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱。快速、 方便、從150 ml大(dà)腸杆菌LB((Luria-Bertani)培養液中，可(kě)快速提取典型産量30-50μg高(gāo)純度BAC質粒DNA，提取率達80-90 %。

2、獲得(de)的質粒産量高(gāo)，超螺旋比例高(gāo)，純度好，可(kě)直接用于轉染、測序、文庫等各種分子生(shēng)物學實驗。

3、內(nèi)毒素含量極低(dī)（< 0.1 EU/μg DNA），可(kě)直接應用于細胞轉染。

注意事項

1、提取的質粒量與細菌培養濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有(yǒu)關。如果所提質粒為(wèi)低(dī)拷貝質粒或大(dà)于10kb 的大(dà)質粒，應加大(dà)菌體(tǐ)使用量，同時(shí)按比例增加A、B、E的用量。

2、提取大(dà)質粒時(shí)操作(zuò)動作(zuò)要輕柔，應該使用剪大(dà)了開(kāi)口的吸頭，防止機械剪切對DNA的損壞。

3、DNA沉澱液沉澱離心後，可(kě)能看不到明(míng)顯沉澱。如未見沉澱，擔心DNA丢失，可(kě)保留上(shàng)清液，待完成全部操作(zuò)後電(diàn)泳鑒定，以确定是否獲得(de)終産物（數(shù)百微克DNA離心沉澱在管的側壁上(shàng)，可(kě)能無法看到明(míng)顯團塊）。

4、得(de)到的質粒DNA可(kě)用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和(hé)紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD260值為(wèi)1相當于大(dà)約50μg/ml DNA。電(diàn)泳可(kě)能為(wèi)單一條帶，也可(kě)能為(wèi)2條或者多(duō)條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時(shí)間(jiān)長短(duǎn)、提取時(shí)操作(zuò)劇(jù)烈程度等有(yǒu)關。本公司産品正常操作(zuò)情況下基本超螺旋可(kě)以超過95%。

操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

​​​​​​​提示：将RNase A全部加入溶液A中，混勻，使用後置于2-8℃保存。

1、取過夜培養菌150 ml左右菌液（最大(dà)不超過180ml-200ml），裝入合适的離心瓶中，10,000 x g于4℃離心2 min沉澱菌體(tǐ)，完全棄除上(shàng)清。

2、加入5 ml 溶液A，充分混懸震蕩菌體(tǐ)沉澱，使其完全分散開(kāi)，至無絮塊存在。細菌懸液移入50 ml離心管中，室溫放置3~5 min。  

如果有(yǒu)未徹底混勻的菌塊，會(huì)影(yǐng)響裂解，導緻提取量和(hé)純度偏低(dī)。

3、加入5 ml 溶液B，輕輕颠倒離心管6~8次，室溫放置4-5 min，使細菌完全裂解，溶液透明(míng)。

溫和(hé)地混合，不要劇(jù)烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時(shí)不應超過5分鍾！以免質粒受到破壞。此時(shí)菌液應變得(de)清亮粘稠，如果菌體(tǐ)少(shǎo)，很(hěn)快清亮粘稠後就可(kě)以做(zuò)下一步，不是一定要準确的5分鍾。如果未變得(de)清亮，可(kě)能由于菌體(tǐ)過多(duō)，裂解不徹底，應減少(shǎo)菌體(tǐ)量。

4、加5 ml溶液E，立即颠倒離心管6~8次，充分混勻，至白色絮狀物産生(shēng)。上(shàng)述裂解液于4℃ 12,000~16,000 x g離心10~15 min，小(xiǎo)心吸出上(shàng)清，移入新的50 ml離心管中。

加入溶液E後應該立即混勻，以免産生(shēng)SDS的局部沉澱。

5、加入10 ml 異丙醇，颠倒離心管，充分混勻。

注意： 使用異丙醇沉澱，蛋白雜質和(hé)鹽離子共沉澱較少(shǎo)，可(kě)能看不到明(míng)顯的較大(dà)團塊沉澱，但(dàn)是質粒還(hái)是可(kě)以完全沉澱下來(lái)，不影(yǐng)響實際的質粒産量。如果你(nǐ)習慣看見較大(dà)的沉澱團塊操作(zuò)，可(kě)以選擇2倍體(tǐ)積的無水(shuǐ)乙醇沉澱。

6、于4℃ 12,000~16,000 x g離心10 min，小(xiǎo)心棄去上(shàng)清，倒置于吸水(shuǐ)紙上(shàng)輕輕瀝幹殘餘液體(tǐ)，加入3-5ml 70%乙醇漂洗一遍，最高(gāo)速離心5分鍾，棄上(shàng)清，晾幹沉澱。

DNA沉澱如果幹燥過頭，DNA将無法完全溶解，但(dàn)是如果乙醇沒有(yǒu)晾幹揮發幹淨，殘留太多(duō)，也會(huì)造成DNA無法完全溶解。

注意：異丙醇離心沉澱後，質粒純度很(hěn)高(gāo)吸附在管底和(hé)側壁可(kě)能看不見沉澱，但(dàn)是不影(yǐng)響産量，後續步驟仔細吹打管底和(hé)沉澱所在的側壁涮洗溶解質粒。

7、加入1.4 ml 溶液A完全溶解沉澱團塊，注意附着在管底和(hé)側壁上(shàng)的質粒沉澱雖然可(kě)能看不見，也要吹打管底和(hé)沉澱所在的側壁涮洗下來(lái)（大(dà)質粒可(kě)用寬口吸管輕輕吹打輔助溶解）。然後将質粒溶液轉入2個(gè)新的1.5 ml離心管中（每個(gè)700μl）。

可(kě)選步驟（一般不需要）：如果菌株RNA豐富有(yǒu)微量RNA殘留，可(kě)在此步驟後将質粒溶液 60℃孵育15 min消化RNA。

8、每管加入55μl雜質清除液A，颠倒充分混勻後加入約0.1體(tǐ)積(約80μl)冰預冷的內(nèi)毒素清除劑ER，颠倒旋轉7-10次（30秒(miǎo)左右）充分混勻，冰浴或者冰上(shàng)放置>=5分鍾，中間(jiān)偶爾颠倒混勻幾次。

內(nèi)毒素清除劑ER加入上(shàng)清後，上(shàng)清會(huì)變得(de)渾濁，但(dàn)是冰浴後應恢複清亮。

注意：如果不需要去內(nèi)毒素用于轉染，可(kě)在此步驟隻加入55μl雜質清除液A，充分混勻後冰上(shàng)放置5分鍾，離心後小(xiǎo)心取上(shàng)清轉入一個(gè)新管，直接接步驟11。

9、42℃水(shuǐ)浴，溶液又會(huì)變為(wèi)渾濁，颠倒混勻後42℃溫育5分鍾。

10、室溫14,000 x g離心5 min分相（溫度低(dī)時(shí)，內(nèi)毒素清除劑ER無法分相，因此必須至少(shǎo)20℃以上(shàng)室溫離心或者保證冬季轉頭溫度20℃以上(shàng)）。上(shàng)層水(shuǐ)相含DNA，下層藍(lán)色油狀相含內(nèi)毒素和(hé)其它雜質。将含DNA的上(shàng)層水(shuǐ)相轉移到新管（注意不要吸到藍(lán)色油狀層，裏面含內(nèi)毒素等雜質），棄油狀層。

溶液必須分為(wèi)上(shàng)下兩相，否則應重複步驟9-10。

11、将上(shàng)一步所得(de)上(shàng)層水(shuǐ)相中加入等體(tǐ)積雜質清除液B（約750μl），輕柔混勻，4℃ 14,000 x g離心10 min，棄上(shàng)清（注意不要丢失DNA），輕輕加入1 ml 70%乙醇洗滌，離心棄上(shàng)清，共兩次，室溫倒置晾幹5~10 min使乙醇完全揮發。

12、每個(gè)離心管加适量TE或者純水(shuǐ)（50~100μl）溶解沉澱（可(kě)在37℃水(shuǐ)浴中振蕩以輔助溶解）。要注意很(hěn)多(duō)質粒DNA可(kě)能附着在離心管側壁上(shàng)，即使看不見，也應該充分吹打側壁溶解回收質粒DNA。

最後沉澱可(kě)以根據需要選擇任意小(xiǎo)體(tǐ)積溶解，這樣可(kě)以得(de)到很(hěn)高(gāo)濃度的轉染級質粒DNA（高(gāo)達3-5μg/μl）。如果有(yǒu)需要，客戶也可(kě)以選擇更大(dà)體(tǐ)積溶解。