目錄号：PE109

試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

儲存事項:

1、第一次使用時(shí)，将試劑盒所帶全部的RNase A加入溶液A後（終濃度100μg/ml）置于4℃保存。如果溶液A中RNase A失活，提取的質粒可(kě)能會(huì)有(yǒu)微量RNA殘留，在溶液A中補加RNase A即可(kě)。

2、環境溫度低(dī)時(shí)溶液B中SDS可(kě)能會(huì)析出出現渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

3、避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

産品介紹：

本試劑盒采用改進SDS-堿裂解法裂解細胞，離心吸附柱內(nèi)的矽基質膜在高(gāo)鹽、低(dī)pH值狀态下選擇性地結合溶液中的質粒DNA，再通(tōng)過去蛋白液和(hé)漂洗液将雜質和(hé)其它細菌成分去除，最後低(dī)鹽、高(gāo)pH值的洗脫緩沖液将純淨質粒DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

産品特點：

1、離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

2、不需要使用有(yǒu)毒的苯酚、氯仿等試劑，也不需要乙醇沉澱。快速、方便，從150-300ml大(dà)腸杆菌LB((Luria-Bertani)培養液中，可(kě)快速提取0.2-1.5mg純淨的高(gāo)拷貝質粒DNA，提取率達80 %左右。

3、獲得(de)的質粒産量高(gāo)、超螺旋比例高(gāo)、純度好，可(kě)以直接用于酶切、轉化、PCR、體(tǐ)外轉錄、測序等各種分子生(shēng)物學實驗。

注意事項

1、本試劑盒适用菌株為(wèi)XL-1 Blue、Top10和(hé)DH5α等核酸酶含量低(dī)缺陷型菌株。所用菌株為(wèi)JM系列、HB101等endA菌株或野生(shēng)型菌株，核酸酶含量豐富，應購買本公司生(shēng)産的高(gāo)純度質粒大(dà)量快速提取試劑盒(PE110)。

2、所有(yǒu)的離心步驟如未加另外說明(míng)均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到12,000 x g，帶50ml轉頭的台式離心機。

3、提取質粒的量與細菌培養濃度、質粒拷貝數(shù)等因素有(yǒu)關。如果所提質粒為(wèi)低(dī)拷貝質粒或大(dà)于10kb 的大(dà)質粒，應加大(dà)菌體(tǐ)使用量，同時(shí)按比例增加A、B、D的用量，洗脫緩沖液應在70℃預熱。可(kě)以适當的延長吸附和(hé)洗脫的時(shí)間(jiān)，提高(gāo)提取效率。

4、得(de)到的質粒DNA可(kě)用瓊脂糖凝膠電(diàn)泳和(hé)紫外分光光度計(jì)檢測濃度與純度。OD260值為(wèi)1相當于大(dà)約50μg/ml DNA。電(diàn)泳可(kě)能為(wèi)單一條帶，也可(kě)能為(wèi)2條或者多(duō)條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構象質粒泳動位置不一造成，與提取物培養時(shí)間(jiān)長短(duǎn)、提取時(shí)操作(zuò)劇(jù)烈程度等有(yǒu)關。本公司産品正常操作(zuò)情況下基本超螺旋可(kě)以超過90%。

5、質粒DNA确切分子大(dà)小(xiǎo)，必須酶切線性化後，對比DNA分子量Marker才可(kě)以知道(dào)。處于環狀或者超螺旋狀态的質粒，泳動位置不确定，無法通(tōng)過電(diàn)泳知道(dào)其确切大(dà)小(xiǎo)。

6、洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA，不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫， 但(dàn)應該确保pH大(dà)于7.5，pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫，質粒應該保存－20℃。質粒DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫 （10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

    ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB瓶中加入指定量無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

    ● 将RNase A全部加入溶液A中，混勻。每次使用後置于2-8℃保存。

1、取150-200 ml (最多(duō)不超過300 ml)過夜培養的菌液，12,000 x g（約10,000rpm），離心1-2分鍾，盡可(kě)能的倒幹上(shàng)清，收集菌體(tǐ)。

收集超過50毫升菌液，可(kě)以離心棄上(shàng)清後，在同一個(gè)50ml管內(nèi)加入更多(duō)的菌液，重複步驟1，直到收集到足夠的菌體(tǐ)。

2、用7.5ml溶液A重懸菌體(tǐ)沉澱，移液器(qì)吹打或者渦旋振蕩至徹底懸浮。  

如果有(yǒu)未徹底混勻的菌塊，會(huì)影(yǐng)響裂解，導緻提取量和(hé)純度偏低(dī)。

3、加7.5ml的溶液B，溫和(hé)地上(shàng)下翻轉6-8次使菌體(tǐ)充分裂解，室溫放置4-5分鍾。

溫和(hé)地混合，不要劇(jù)烈震蕩，以免基因組DNA剪切斷裂！所用時(shí)間(jiān)不應超過5分鍾！以免質粒受到破壞。此時(shí)菌液應變得(de)清亮粘稠。如果很(hěn)渾濁，可(kě)能由于菌體(tǐ)過多(duō)，裂解不徹底，應減少(shǎo)菌體(tǐ)量。

4、加7.5ml溶液D，立即溫和(hé)地上(shàng)下翻轉6 -8次，充分混勻此時(shí)會(huì)出現白色絮狀沉澱。12,000 x g離心10-15分鍾，小(xiǎo)心取上(shàng)清至新管，避免吸取到漂浮的白色沉澱。

加入溶液D後應該立即混勻，以免産生(shēng)SDS的局部沉澱。

5、向上(shàng)清中加入0.5體(tǐ)積異丙醇（約10ml）後充分颠倒混勻後分多(duō)次（每次不超過15ml）轉入吸附柱DC中（吸附柱放入收集管CT中），12,000 x g離心1分鍾，倒掉收集管CT中的廢液。直到所有(yǒu)混合溶液通(tōng)過此吸附柱。

6、加入10ml漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 x g離心1分鍾，棄掉廢液。再加入10ml漂洗液WB，重複漂洗一次。

7、将吸附柱DC放回空(kōng)收集管CT中，最高(gāo)速（最好大(dà)于12,000 x g）離心3分鍾以幹燥基質膜上(shàng)殘留乙醇，用槍頭吸除內(nèi)圈壓環和(hé)柱壁之間(jiān)可(kě)能殘留的乙醇，打開(kāi)蓋子室溫晾幹3-5分鍾。

該步驟為(wèi)徹底去除吸附柱中殘留乙醇，殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應并且嚴重降低(dī)洗脫效率，降低(dī)質粒産量。

8、取出吸附柱DC，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加1-2ml洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中預熱可(kě)提高(gāo)産量），室溫放置3分鍾，12,000 x g離心3分鍾。 

推薦：為(wèi)了增加質粒的回收效率，可(kě)将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置3分鍾，12,000 x g離心3分鍾。洗脫兩遍可(kě)提高(gāo)濃度約10%。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要質粒濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是需注意體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)質粒洗脫效率，減少(shǎo)質粒産量（最小(xiǎo)不應少(shǎo)于1ml）。