1/适用範圍：

适用于快速提取各種酵母基因組DNA。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

                                   本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項:

① 結合液CB或者抑制(zhì)物去除液IR低(dī)溫時(shí)可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在37℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解，恢複澄清透明(míng)後冷卻到室溫即可(kě)使用。

② 為(wèi)避免降低(dī)活性，方便運輸，提供蛋白酶K為(wèi)凍幹粉狀（20mg），收到後，可(kě)短(duǎn)暫離心後，加入1毫升滅菌水(shuǐ)溶解配制(zhì)成20mg/ml溶液，因為(wèi)反複凍融可(kě)能會(huì)降低(dī)酶活性，因此溶解後立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。

③ Lytic Enzyme為(wèi)蝸牛酶甘油儲液，因此比較粘稠，請(qǐng)小(xiǎo)心取用，－20℃保存。 蝸牛酶是從蝸牛的嗦囊和(hé)消化道(dào)中制(zhì)備的混合酶，它含有(yǒu)纖維素酶，果膠酶，澱粉酶，蛋白酶等20多(duō)種酶。适合破碎溶解各種酵母的細胞壁。

④ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

該試劑盒采用DNA吸附柱和(hé)獨有(yǒu)的溶液系統，适合于從多(duō)種來(lái)源的酵母培養物中快速簡單地提取基因組DNA。約3ml處于指數(shù)生(shēng)長期的酵母培養液一般一次抽提可(kě)純化出10-15μg的高(gāo)質量的基因組DNA。純化DNA産物可(kě)直接用于PCR、酶切和(hé)雜交等實驗。酵母細胞經lytic Enzyme處理(lǐ)去除細胞壁後，獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞內(nèi)核酸酶，然後基因組DNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟， 抑制(zhì)物去除液和(hé)漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最後低(dī)鹽的洗脫緩沖液将純淨基因組DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

① 離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

② 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

③ 快速，簡捷，單個(gè)樣品裂解後操作(zuò)一般可(kě)在30分鍾內(nèi)完成。

④ 多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，可(kě)直接用于PCR，Southern-blot和(hé)各種酶切反應。

6/注意事項：

① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的傳統台式離心機。

② 需要自備乙醇、異丙醇、 β-巯基乙醇。

③ 開(kāi)始實驗前将需要的水(shuǐ)浴先預熱到37℃和(hé)70℃備用。

④ 結合液CB 和(hé)抑制(zhì)物去除液IR中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

⑤ 用戶需要自備Sorbitol buffer( 1M 山(shān)梨醇， 0.1M Na2EDTA，14 mMβ-巯基乙醇)。配制(zhì)方法：在600 ml 去離子水(shuǐ)裏面溶解 182.2克山(shān)梨醇，加入200 ml 0.5 M Na2EDTA (pH 8.0) ，不需要調節PH值，定容到1L，4℃保存。臨用前加0.2%β-巯基乙醇(商品化的β-巯基乙醇摩爾濃度一般為(wèi)14M)。

⑥ 菌體(tǐ)濃度檢測一般OD260值為(wèi)1的時(shí)候,釀酒酵母細胞是1-2x107 cells/ml，由于菌種和(hé)分光度計(jì)不同即使同樣細胞數(shù)量OD值變化也很(hěn)大(dà)，以上(shàng)僅供參考。

⑦ 洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA，不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫，但(dàn)應該确保批pH大(dà)于7.5， pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：● 第一次使用前請(qǐng)先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

1.  ● 吸取使用量的Sorbitol buffer加入0.2%β-巯基乙醇，回複到室溫備用。
2.  
3. 1、取1-3毫升酵母培養物(不超過3X107 cells，最好是早對數(shù)生(shēng)長期)，12,000rpm離心30秒(miǎo)，盡可(kě)能的吸棄上(shàng)清，收集菌體(tǐ)。收集超過1.5毫升菌液，可(kě)以離心棄上(shàng)清後，在同一個(gè)1.5ml管內(nèi)加入更多(duō)的菌液，重複步驟1，直到收集到足夠的菌體(tǐ)。
4. 2、加入300μl Sorbitol buffer，輕柔吹打充分重懸細胞；再加入50μl Lytic Enzyme儲液，充分颠倒混勻，37℃溫育1-3小(xiǎo)時(shí)消化細胞壁，中間(jiān)可(kě)颠倒數(shù)次幫助消化。如果破壁效果不好導緻産量低(dī)，可(kě)以加大(dà)Lytic Enzyme 用量來(lái)提高(gāo)酶工作(zuò)濃度，還(hái)可(kě)以延長消化時(shí)間(jiān)或者提高(gāo)溫度到45℃來(lái)提高(gāo)效果，不适合Lytic Enzyme消化的酵母可(kě)選用其它方法如0.5mm玻璃珠渦旋擊打 ，反複凍融等。玻璃珠法：向菌體(tǐ)中加入180μl 緩沖液Y徹底懸浮菌體(tǐ)，加入0.1g直徑為(wèi)0.45-0.55mm的酸洗玻璃珠，渦旋振蕩10分鍾，靜置幾分鍾讓玻璃珠沉澱，小(xiǎo)心吸取上(shàng)清到一個(gè)新管後接後續步驟4。
5. 3、13,000rpm離心1分鍾，盡可(kě)能吸棄上(shàng)清，加180μl 緩沖液Y充分重懸細胞團。
6. 4、加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。
7. 5、将混合物放置在55℃水(shuǐ)浴消化直到消化完全，期間(jiān)輕柔的振蕩幾次幫助裂解。所需消化時(shí)間(jiān)和(hé)酵母數(shù)量、種類和(hé)生(shēng)長狀态有(yǒu)關，一般15分鍾即可(kě)，但(dàn)是如果方便的話(huà)消化過夜也無不良影(yǐng)響。可(kě)選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多(duō)，需要去除RNA，可(kě)在完成操作(zuò)步驟5後加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鍾。
8. 6、加入200μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鍾。
9. 7、冷卻後加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可(kě)能會(huì)出現絮狀沉澱。
10. 8、将上(shàng)一步混合物（包括可(kě)能有(yǒu)的沉澱）加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管CT中）13,000rpm離心30-60秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。
11. 9、加入500μl抑制(zhì)物去除液IR，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄廢液。
12. 10、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。
13. 11、加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。
14. 12、将吸附柱DA放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。
15. 13、取出吸附柱DA，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中預熱效果更好）， 室溫放置3-5分鍾，12,000rpm 離心1分鍾。将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鍾，12,000rpm離心1分鍾。洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要DNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于50μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)DNA洗脫效率，減少(shǎo)DNA産量。
16. 14、DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。

8/問題與解決方法：