1/适用範圍：

适用于提取凋亡DNA Ladder。 

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

3/注意事項：

為(wèi)保持活性方便運輸，Enzyme B客戶收到時(shí)為(wèi)凍幹粉，收到後加500µl滅菌水(shuǐ)（25次）或者1ml滅菌水(shuǐ)（50次）溶解後－20 ºC保存。Enzyme A和(hé)Enzyme B為(wèi)酶溶液，應該避免反複凍融降低(dī)活性，如果要分多(duō)次使用，最好按照每次使用量分裝後－20 ºC保存。

4/産品介紹：

凋亡(apoptosis)或程序性死亡的細胞一個(gè)形态學的顯著特點是染色體(tǐ)DNA以核小(xiǎo)體(tǐ)為(wèi)單位（185 bp）規律斷裂形成長度約為(wèi)n×185bp (n=1,2,3,4…) 的DNA片段，經瓊脂糖凝膠電(diàn)泳顯示為(wèi)階梯狀凋亡DNA Ladder，是凋亡細胞最直觀的特征。本試劑盒選擇性從組織和(hé)細胞中分離提取凋亡DNA ladder，通(tōng)過選擇性分離基因組DNA與凋亡DNA ladder，最大(dà)限度的減少(shǎo)了基因組DNA對凋亡DNA ladder的觀察幹擾，因此顯著的提高(gāo)了檢測敏感度，反應可(kě)在微量離心管進行(xíng)，2.5小(xiǎo)時(shí)完成，快速方便；無需有(yǒu)機抽提，檢測靈敏度極高(gāo)，可(kě)從約2000個(gè)凋亡細胞中檢測到DNA ladder。推薦起始細胞量為(wèi)5～10 × 105 個(gè)，但(dàn)投入的細胞量可(kě)在1 × 105 ~ 5 × 106之間(jiān)變化。原則是總細胞中應含有(yǒu)至少(shǎo)約1～2 × 104個(gè)凋亡細胞。多(duō)于2 × 104個(gè)凋亡細胞通(tōng)常可(kě)獲得(de)十分清晰的凋亡DNA ladder。本試劑盒也可(kě)用于從組織中提取凋亡DNA ladder。但(dàn)與培養細胞相比，整體(tǐ)動物組織凋亡細胞出現的時(shí)間(jiān)、部位、程度等規律性差往往造成難以準确取材，可(kě)能顯著影(yǐng)響實驗結果。但(dàn)隻要組織确實發生(shēng)凋亡，有(yǒu)經驗的用戶也可(kě)以使用本試劑盒從組織提取凋亡DNA ladder (參見說明(míng)4)。

5/産品說明(míng):

① 溴化乙錠染色過度将降低(dī)DNA條帶檢測靈敏度，可(kě)用水(shuǐ)沖洗凝膠10～30分鍾。如沖洗過頭可(kě)再用溴化乙錠複染。可(kě)用更靈敏的DNA染色劑SYBR Green。也可(kě)進行(xíng)丙烯酰胺DNA凝膠電(diàn)泳和(hé)DNA銀染。

② 對細胞進行(xíng)幹預處理(lǐ)後，凋亡可(kě)能僅在某一時(shí)間(jiān)點或某一幹預強度下最為(wèi)明(míng)顯。需要進行(xíng)預試驗确定最佳幹預時(shí)間(jiān)或強度。此時(shí)也可(kě)用凋亡小(xiǎo)體(tǐ)/hoeschst染色試劑盒(DN1801)快速染色凋亡小(xiǎo)體(tǐ)觀察。

③ 推薦起始細胞量為(wèi)5～10 × 105 個(gè)，但(dàn)投入的細胞量可(kě)在1 × 105 ~ 5 × 106之間(jiān)變化。原則是總細胞中應含有(yǒu)至少(shǎo)約1～2 × 104個(gè)凋亡細胞。多(duō)于2 × 104個(gè)凋亡細胞通(tōng)常可(kě)獲得(de)十分清晰的凋亡DNA ladder。六孔闆的一個(gè)孔相當于一個(gè)35 mm培養皿長滿後可(kě)得(de)到1～10 ×105 個(gè)細胞，如果細胞凋亡發生(shēng)率為(wèi)10%，經過處理(lǐ)可(kě)得(de)到約1～10 × 104個(gè)凋亡細胞，應該足以獲得(de)清晰的凋亡DNA ladder。反之如果不能從>3 ×106個(gè)細胞獲得(de)清晰的凋亡DNA ladder，表明(míng)其中凋亡細胞少(shǎo)于1%。此時(shí)增加細胞用量也難已奏效。

④ 從組織塊提取凋亡DNA ladder。取10～20 mg組織塊放入小(xiǎo)玻璃勻漿器(qì)，加100～200μl Extraction buffer，上(shàng)下手動勻漿15～20次。取出勻漿液，冰上(shàng)5～10 min。振蕩10秒(miǎo)。4500 rpm 10分鍾收集上(shàng)清液并轉移到新1.5ml離心管，執行(xíng)提取步驟3。另外一種方法是将30～50mg組織剪碎後在PBS裏面勻漿，制(zhì)成細胞懸液，離心收集細胞後接步驟2繼續執行(xíng)提取。

⑤ 采用高(gāo)質量瓊脂糖，使用寬度較小(xiǎo)和(hé)厚度較窄的樣品梳子，制(zhì)作(zuò)較薄的瓊脂糖凝膠(厚度約2～4 mm)；用較低(dī)的電(diàn)壓進行(xíng)慢速電(diàn)泳，将顯著增加凋亡DNA條帶檢測靈敏度。電(diàn)泳距離不要太長，否則将使小(xiǎo)的凋亡DNA條帶彌散而降低(dī)分辨率。

6/操作(zuò)步驟：

1、用PBS漂洗細胞兩遍後微型離心機500 ×g 4ºC 5 min收集5～10 × 105個(gè)細胞（最好同時(shí)做(zuò)一個(gè)未凋亡細胞的對照）。小(xiǎo)心用移液槍吸棄上(shàng)清，除盡管壁附着液體(tǐ)。

2、将離心管底部的細胞沉澱用手指輕輕彈松打散後，加入100µl的Extraction buffer，用振蕩器(qì)激烈混合10秒(miǎo)鍾後，1,100～1,600 xg(約3500～4500 rpm)離心5分鍾。

3、勿觸動管底沉澱，将上(shàng)清液轉移到新的1.5ml離心管。

4、沉澱按操作(zuò)2.方法再重複一次。

5、把上(shàng)清液與操作(zuò)3.的上(shàng)清液合并于一起共約200µl，作(zuò)為(wèi)粗提取液(含有(yǒu)凋亡DNA片段，未凋亡染色體(tǐ)DNA已經通(tōng)過沉澱去除)。

6、向粗提取液中加入10% SDS 溶液 20µl後，再加入Enzyme A 20µl，混勻，56℃溫育1小(xiǎo)時(shí)。

7、向上(shàng)述混合液中加入Enzyme B 20µl，混勻，37℃溫育1小(xiǎo)時(shí)，或者直到變得(de)透亮（可(kě)過夜）。

8、向上(shàng)述混合液中加入Precipitant 130µl後，颠倒混勻，再加入1 ml的乙醇，混勻後- 20℃放置1小(xiǎo)時(shí)以上(shàng)（沉澱凋亡DNA片段）。

9、至少(shǎo)13000rpm 4ºC離心15min，棄上(shàng)清，加1ml 70％乙醇漂洗一遍後離心，倒去乙醇，并且盡量吸除管壁附着液體(tǐ)。敞開(kāi)管口，室溫晾幹沉澱。

10、用17µl雙蒸水(shuǐ)或TE Buffer充分溶解沉澱，加3µl 6 x DNA凝膠上(shàng)樣緩沖液震蕩混勻。取全部20µl 上(shàng)樣或者适量上(shàng)樣進行(xíng)1% agarose gels電(diàn)泳。溴化乙錠染色，紫外觀察照相（凋亡發生(shēng)率較低(dī)時(shí)，添加過量TE Buffer溶解沉澱有(yǒu)可(kě)能會(huì)導緻濃度太稀，無法檢出DNA Ladder，因此可(kě)減少(shǎo)用量，反之，可(kě)增加）。