1/适用範圍：

适用于快速提取各種糞便DNA。 

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

                                  本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

雜質清除劑AB升級，可(kě)以室溫存放，使用更方便。

3/儲存事項:

① 緩沖液ASL或者結合液CB低(dī)溫時(shí)可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在70℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新充分溶解，恢複澄清透明(míng)後冷卻到室溫即可(kě)使用。

② 為(wèi)避免降低(dī)活性，方便運輸，提供蛋白酶K為(wèi)凍幹粉狀，收到後，可(kě)短(duǎn)暫離心後，加入1ml滅菌水(shuǐ)溶解，因為(wèi)反複凍融可(kě)能會(huì)降低(dī)酶活性，因此溶解後立即按照每次使用量(20μl)分裝凍存，－20℃保存。

③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

常規的DNA純化方式并不能有(yǒu)效地去除糞便中存在的大(dà)量抑制(zhì)因子而導緻下遊實驗的失敗，如PCR不能擴增出所需片段。該試劑盒采用DNA吸附柱和(hé)新型獨特的溶液系統，能有(yǒu)效去除動物糞便中各種影(yǐng)響下遊實驗（如PCR）的抑制(zhì)因子，并能高(gāo)效地回收糞便中的基因組DNA。動物糞便樣品經特殊緩沖液ASL重懸後，70℃處理(lǐ)5分鍾裂解細菌；離心去除不溶解的雜質，蛋白酶K消化進一步去除蛋白和(hé)雜質；然後基因組DNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟， 抑制(zhì)物去除液和(hé)漂洗液将細胞代謝物、蛋白等雜質去除， 最後低(dī)鹽的洗脫緩沖液将純淨基因組DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

① 離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

② 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

③ 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在40分鍾內(nèi)完成。

④ 多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，可(kě)直接用于PCR，Southern-blot和(hé)各種酶切反應。

6/注意事項:

① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的傳統台式離心機。

② 開(kāi)始實驗前将需要的水(shuǐ)浴先預熱到70℃備用。

③ 結合液CB 和(hé)抑制(zhì)物去除液IR中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

④ 洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA， 不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫， 但(dàn)應該确保pH大(dà)于7.5， pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

⑤ PCR可(kě)能被過量的DNA（一般大(dà)于1μg）抑制(zhì)，使用最小(xiǎo)用量的洗脫DNA（适當稀釋）反而可(kě)以得(de)到更好的擴增。一般加入的洗脫DNA體(tǐ)積不要超過總PCR反應體(tǐ)積的10％。我們建議在PCR反應體(tǐ)系中加入終濃度0.1 μg/μl的BSA（牛血清白蛋白）有(yǒu)助于得(de)到最佳擴增效果。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在15ml漂洗液WB中加入60ml無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

1、收集約200-220mg糞便到一個(gè)2ml離心管，置冰上(shàng)。

如果是冰凍的标本，加入緩沖液ASL前不能解凍，否則DNA容易降解。

2、加1.4ml 緩沖液ASL，連續渦旋振蕩1分鍾或者直到完全混勻均一。注意完全渦旋混勻，否則會(huì)嚴重降低(dī)産量。

3、将重懸物70℃溫育5分鍾。該加熱步驟可(kě)以提高(gāo)3-5倍DNA産量，并且幫助裂解細菌和(hé)寄生(shēng)蟲。對于某些(xiē)難裂解的細胞（如革蘭氏陽性菌）可(kě)以提高(gāo)到95℃。

4、渦旋振蕩15秒(miǎo)，室溫放置1分鍾。最高(gāo)速離心1分鍾沉澱糞便顆粒。

5、轉移900μl上(shàng)清到一個(gè)1.5ml離心管，加入100μl雜質清除劑AB，立刻渦旋振蕩1分鍾或者直到完全混勻均一，室溫放置1分鍾。最高(gāo)速離心3分鍾去除雜質。

6、轉移所有(yǒu)上(shàng)清到一個(gè)1.5ml離心管，最高(gāo)速離心3分鍾。

7、轉移210μl上(shàng)清到一個(gè)1.5ml離心管，加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，加入200μl 結合液CB，渦旋振蕩15秒(miǎo)，充分混勻。70℃溫育10分鍾。如果産量偏低(dī)，可(kě)以轉移更多(duō)的上(shàng)清，并且相應的按比例提高(gāo)蛋白酶K和(hé)結合液的和(hé)後面的異丙醇使用量。

8、冷卻後加入100μl 異丙醇，渦旋混勻。

9、将上(shàng)一步所得(de)溶液和(hé)可(kě)能出現的沉澱都加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管CT中）13,000rpm離心30秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。

10、加入500μl抑制(zhì)物去除液IR，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄廢液。

11、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

12、加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

13、将吸附柱DA放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

14、取出吸附柱DA，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加100－150μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液可(kě)事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中預熱）， 室溫放置2分鍾，12,000rpm 離心1分鍾。将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鍾，12,000rpm離心1分鍾。洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要DNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于50μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)DNA洗脫效率，減少(shǎo)DNA産量。

15、DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。

8/問題與解決方法: