1/适用範圍：

适用于快速λ噬菌體(tǐ)DNA。 

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

                                                本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項:

① 在RNase A管和(hé)DNase I管分别加入1毫升的裂解緩沖液LS吹打，颠倒混勻，充分溶解RNase A和(hé)DNase I後， 按照每次使用量分裝－20℃凍存，有(yǒu)效期6個(gè)月。

② 結合液LB低(dī)溫時(shí)可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在37℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解，恢複澄清透明(míng)後冷卻到室溫即可(kě)使用。

③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

λ噬菌體(tǐ)載體(tǐ)廣泛用于文庫篩選，目的克隆培養獲得(de)大(dà)量的噬菌體(tǐ)顆粒需要提取λ噬菌體(tǐ)DNA來(lái)開(kāi)展測序等後續工作(zuò)。λ噬菌體(tǐ)裂解培養物離心後的上(shàng)清，首先用RNase A /DNase I混合酶消化去除殘留的宿主菌DNA/RNA，沉澱收集噬菌體(tǐ)，噬菌體(tǐ)被SDS裂解，殘留碎片通(tōng)過沉澱離心去除掉。裂解物上(shàng)清中的λ噬菌體(tǐ)DNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜，再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟，将鹽、細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最後低(dī)鹽的洗脫緩沖液将λ噬菌體(tǐ)DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

① 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

② 節省時(shí)間(jiān)，簡捷，可(kě)用于液體(tǐ)培養裂解物和(hé)固體(tǐ)培養闆的提取，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在1.5小(xiǎo)時(shí)內(nèi)完成。

③ 産量高(gāo)，典型的産量10ml λ噬菌體(tǐ)裂解培養物上(shàng)清可(kě)以提取約10µg λ噬菌體(tǐ)DNA。

④ 多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9。可(kě)以直接用來(lái)酶切和(hé)測序。

6/注意事項

① 使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的冷凍離心機。

② 開(kāi)始實驗前将需要的水(shuǐ)浴先預熱到37℃備用。

③ 需要自備氯仿，20％SDS。

④ 結合液LB含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

以10 ml噬菌體(tǐ)感染細菌培養上(shàng)清提取舉例：

提示：

● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

● 将噬菌體(tǐ)沉澱液PB放在冰上(shàng)預冷。

1、将0.5%氯仿處理(lǐ)後的λ噬菌體(tǐ)感染的液體(tǐ)培養物10,000g（約12,000rpm） 4℃離心10分鍾去除細胞碎片和(hé)殘渣。 轉速不能過高(gāo)，時(shí)間(jiān)不能過長，否則噬菌體(tǐ)可(kě)能和(hé)碎片一起沉澱，降低(dī)産量。

2、取10ml上(shàng)清，加入20μl RNase和(hé)20μl DNase充分混勻37℃溫育30分鍾。每個(gè)噬菌體(tǐ)培養上(shàng)清因生(shēng)長和(hé)裂解情況不同而殘留RNA/DNA量不等。RNase/DNase消化過頭，可(kě)能減少(shǎo)産量；消化不完全，可(kě)能未消化的DNA/RNA和(hé)細胞碎片粘去部分噬菌體(tǐ)減低(dī)産量并/或者導緻最後污染宿主菌DNA，因此應該根據實際情況适當調節用量和(hé)消化時(shí)間(jiān)。

3、加入2 ml 冰預冷的噬菌體(tǐ)沉澱液PB，輕柔充分混勻後置冰上(shàng)冷卻（培養闆裂解物必須在冰上(shàng)放置30分鍾）。

4、10,000g（12,000rpm）4℃離心10分鍾，棄上(shàng)清，幹燥1分鍾。沉澱下來(lái)的噬菌體(tǐ)外觀為(wèi)透亮或者稍白的沉澱。

5、加入500μl裂解緩沖液LS，吹打重懸噬菌體(tǐ)，加入100μl 20％SDS，立即輕柔颠倒混勻4-6次後，70℃溫育10分鍾，然後置冰上(shàng)冷卻。

6、加入100μl雜質沉澱液IP，立即輕柔颠倒混勻4-6次，最高(gāo)速13,000g 4℃離心10分鍾。

7、仔細将上(shàng)清轉入新的離心管，加入350μl結合液LB，輕柔渦旋混勻。

8、将上(shàng)述混合物加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱放入收集管CT中）12,000rpm離心30秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。吸附柱一次最多(duō)隻可(kě)以容納大(dà)約700μl混合物，因此需要分次把混合物移到吸附柱內(nèi)，重複步驟8。

9、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄廢液。

10、可(kě)選步驟：重複步驟9一遍。

11、将吸附柱DA放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

12、取出吸附柱DA，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 50℃水(shuǐ)浴中預熱）， 室溫放置1分鍾，12,000rpm 離心1分鍾。如果想得(de)到較多(duō)量的DNA，可(kě)将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，12,000rpm離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要DNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于40μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)DNA洗脫效率，減少(shǎo)DNA産量。

13、DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在-20℃。

8/問題與解決方法: