1/适用範圍：

适用于瓊脂糖凝膠DNA回收。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存18個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項:

① 環境溫度低(dī)時(shí)細胞核裂解液NLS中某些(xiē)去污劑成份會(huì)析出出現渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

② 為(wèi)避免降低(dī)活性、方便運輸，提供蛋白酶K為(wèi)凍幹粉狀，收到後，可(kě)短(duǎn)暫離心後，加入0.5 或1ml滅菌水(shuǐ)溶解，因為(wèi)反複凍融可(kě)能會(huì)降低(dī)酶活性，因此溶解後立即按照每次适合使用量分裝凍存，－20℃保存。

③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

本試劑盒根據凝固全血特點獨家(jiā)研制(zhì)的細胞核裂解液NLS配合蛋白酶K裂解凝固血塊釋放出基因組DNA, 然後蛋白沉澱液PPS選擇性沉澱去除蛋白，最後純淨的基因組DNA在Glycogen的助沉下通(tōng)過異丙醇沉澱并重溶解于DNA溶解液。

5/産品特點：

① 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑。

② 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在1小(xiǎo)時(shí)內(nèi)完成。

③ 結果穩定，配合Glycogen幫助沉澱微量DNA，産量高(gāo)，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可(kě)達50kb-150kb，可(kě)直接用于構建文庫、PCR、Southern-blot和(hé)各種酶切反應。

6/注意事項

① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到2,500 x g，并配備容納50ml離心管轉頭的傳統台式離心機（小(xiǎo)量提取，用小(xiǎo)離心機即可(kě)）。

② 用戶需自備異丙醇和(hé)70％乙醇和(hé)TE緩沖液。

③ 典型的凝固血産量1ml全血可(kě)提取出10-30µg基因組DNA（不同凝固程度的樣品産量的個(gè)體(tǐ)差異可(kě)能非常大(dà)）。

④ 本試劑盒為(wèi)溶液型，可(kě)以很(hěn)容易的按照比例擴大(dà)或者縮小(xiǎo)每次處理(lǐ)的全血量（20µl-10ml）。

7/操作(zuò)步驟：（以處理(lǐ)■50μl 和(hé)◆1ml凝固全血舉例）

1、加入■50μl凝固血液至一個(gè)1.5ml 離心管或◆1ml凝固血液至一個(gè)50ml 離心管，劇(jù)烈渦旋或者用手劇(jù)烈拍打離心管幫助打散凝血塊。

2、加入■550μl 或◆11ml 細胞核裂解液NLS，吹打混勻，再加入■3μl 或◆60μl蛋白酶K(20mg/ml)，颠倒混勻25次。

3、55℃放置3小(xiǎo)時(shí)至過夜，直到所有(yǒu)的凝塊完全融解。

4、可(kě)選步驟（一般不需要做(zuò)）：加入■3μl 或◆60μl RNase A（4mg/ml），在裂解物中加入RNase A（10mg/ml）至終濃度30μg/ml，颠倒25次混勻，37℃溫育15分鍾去除殘留RNA。

5、将裂解物迅速冷卻到室溫（可(kě)置冰上(shàng)一分鍾）。

6、加入■200μl 或◆4ml蛋白沉澱液PPS，在渦旋振蕩器(qì)上(shàng)高(gāo)速連續振蕩混勻25秒(miǎo)，混勻後可(kě)能見到一些(xiē)小(xiǎo)的蛋白團塊。

注意液體(tǐ)确實要旋轉着振蕩起來(lái)，而不僅上(shàng)下振動，這樣混勻效果和(hé)沉澱蛋白效果最佳。

7、置冰上(shàng)■5分鍾 或◆10分鍾。

8、■13,000-16,000 x g離心5分鍾或◆2,500 x g(可(kě)根據需要調整加大(dà)離心力)離心10分鍾。這時(shí)候應該可(kě)以見到管底暗褐色的蛋白沉澱，也可(kě)能見到一些(xiē)蛋白沉澱漂浮在液體(tǐ)表面。

9、小(xiǎo)心吸取上(shàng)清到一個(gè)新的■1.5ml 離心管 或◆50ml離心管中。

吸取上(shàng)清時(shí)，注意不要吸到管底的和(hé)漂浮在液體(tǐ)表面的蛋白沉澱。如果不小(xiǎo)心将蛋白沉澱轉入新的離心管中，可(kě)再次離心2分鍾後取上(shàng)清。

10、加入■600μl的室溫異丙醇和(hé)1μl Glycogen溶液或◆12ml室溫異丙醇和(hé)20μl Glycogen溶液，輕柔颠倒50次混勻或者直到出現棉絮狀（絲狀）白色DNA沉澱。

處理(lǐ)樣品量大(dà)的時(shí)候才可(kě)能看見絲狀沉澱，處理(lǐ)樣品量少(shǎo)或者保存質量不好的時(shí)候往往看不見。

11、■13,000-16,000 x g離心1分鍾或◆2,500 x g離心3分鍾，這時(shí)候應該看到管底白色的DNA沉澱。

12、小(xiǎo)心棄上(shàng)清，倒置後在吸水(shuǐ)紙上(shàng)輕敲幾下以控幹殘留乙醇（注意不要丢失沉澱）。

13、加入■600μl或◆12ml 70%乙醇，颠倒幾次漂洗DNA沉澱。

14、■13,000-16,000 x g離心1分鍾或◆2,500 x g離心1分鍾, 倒去上(shàng)清（沉澱很(hěn)松，注意不要把DNA沉澱倒掉了），倒置後在吸水(shuǐ)紙上(shàng)輕敲幾下以控幹殘留乙醇，還(hái)可(kě)以用槍頭小(xiǎo)心吸掉管底沉澱周圍和(hé)管壁的殘留乙醇，空(kōng)氣晾幹沉澱幾分鍾。

注意不要幹燥過頭，否則DNA極其難溶；也不能殘留太多(duō)乙醇，否則乙醇可(kě)能抑制(zhì)下遊如酶切反應。

15、加入■20μl 或◆250-400μl TE緩沖液(或者客戶根據需要選擇的緩沖液)重新水(shuǐ)化溶解DNA沉澱，輕彈管壁混勻，可(kě)以放置在65℃溫育30-60分鍾（不要超過一小(xiǎo)時(shí)），也可(kě)以在室溫或者4℃放置過夜來(lái)重新水(shuǐ)化DNA，中間(jiān)不時(shí)的輕彈管壁幫助重新水(shuǐ)化DNA。

16、DNA可(kě)以存放在2-8℃,如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。