1/适用範圍：
适用于快速提取全血基因組DNA。
2/試劑盒組成、儲存、穩定性：
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試劑盒組成
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保存
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DE102-01
50次
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DE102-02
100次
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DE102-03
200次
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平衡液BS
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室溫
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5 ml
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10 ml
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20 ml
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緩沖液BB
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室溫
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10 ml
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20 ml
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40 ml
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結合液CB
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室溫
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15 ml
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30 ml
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60 ml
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抑制(zhì)物去除液IR
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室溫
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25 ml
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50 ml
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100 ml
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漂洗液WB
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室溫
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15 ml 25 ml 50 ml
第一次使用前按說明(míng)加指定量乙醇
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洗脫緩沖液EB
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室溫
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15 ml
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15 ml
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15 ml x 2
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蛋白酶K粉
20mg/ml
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-20℃
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20mg
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20mg×2
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20mg×4
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吸附柱DA
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室溫
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50個(gè)
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100個(gè)
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200個(gè)
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收集管（2ml）
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室溫
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50個(gè)
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100個(gè)
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200個(gè)
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本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。
3/儲存事項:
① 結合液CB或者抑制(zhì)物去除液IR低(dī)溫時(shí)可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在37℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解，恢複澄清透明(míng)後冷卻到室溫即可(kě)使用。
② 為(wèi)避免降低(dī)活性，方便運輸，提供蛋白酶K為(wèi)凍幹粉狀，收到後，可(kě)短(duǎn)暫離心後，加入1毫升滅菌水(shuǐ)溶解。因為(wèi)反複凍融可(kě)能會(huì)降低(dī)酶活性，因此溶解後立即按照每次使用量分裝凍存，－20℃保存。
③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中發生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。
4/産品介紹：
獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞內(nèi)核酸酶，然後基因組DNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟， 抑制(zhì)物去除液和(hé)漂洗液将細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最後低(dī)鹽的洗脫緩沖液将純淨基因組DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。
5/産品特點：
① 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。
② 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在20分鍾內(nèi)完成。
③ 多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，典型的産量200µl全血可(kě)提取出3-12µg，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可(kě)達30 kb -50kb，可(kě)直接用于PCR、Southern-blot和(hé)各種酶切反應。
④ 從十幾個(gè)配方中優選出的紅細胞裂解液配方，裂解快速完全，客戶可(kě)根據需要選擇購買。
⑤ 典型的産量200µl全血可(kě)提取出3-12µg 基因組DNA。
6/注意事項：
① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。
② 不同樣品尤其疾病樣品中白細胞數(shù)量差異可(kě)能非常大(dà)，因此産量的個(gè)體(tǐ)差異也可(kě)能非常大(dà)。
③ 需要自備異丙醇。
④ 開(kāi)始實驗前将需要的水(shuǐ)浴先預熱到70℃備用。
⑤ 為(wèi)了最佳效果，最好使用新鮮血液标本或者4℃存放少(shǎo)于3天的标本，不要使用反複凍融超過3次的标本，否則會(huì)嚴重降低(dī)産量。
⑥ 洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA，不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫，但(dàn)應該确保批pH大(dà)于7.5， pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。
7/關于平衡液BS的使用
● 介紹：核酸吸附矽膠膜柱子長期放置過程中會(huì)同空(kōng)氣中的電(diàn)荷/塵埃發生(shēng)反應而影(yǐng)響其核酸的結合能力。矽膠柱經平衡液BS預處理(lǐ)後可(kě)大(dà)大(dà)減少(shǎo)柱子中矽膠膜的憎水(shuǐ)基團，提高(gāo)核酸的結合能力。從而提高(gāo)矽膠柱子回收效率或者産量。平衡液BS是強堿性溶液，若不小(xiǎo)心碰到，請(qǐng)用大(dà)量自來(lái)水(shuǐ)清洗。用完後需蓋緊瓶蓋，以免接觸空(kōng)氣。室溫保存。在保存過程中可(kě)能有(yǒu)沉澱生(shēng)成，請(qǐng)加熱至37℃使沉澱完全消失。
● 使用方法：取一個(gè)新的矽膠膜吸附柱子裝在收集管中，吸取100μl的平衡液BS至柱子中。13000 rpm離心1分鍾，倒掉收集管中廢液，将吸附柱子重新放回收集管。此時(shí)平衡液BS預處理(lǐ)柱子完畢。接後續的操作(zuò)步驟。
8/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）
提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!
1、取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。
如果全血起始量小(xiǎo)于200μl，則用緩沖液BB補足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之間(jiān)，則後續操作(zuò)需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300μl-1ml之間(jiān)，則需要先進行(xíng)紅細胞裂解操作(zuò)（見本說明(míng)書(shū)後附錄）。
如果處理(lǐ)血樣為(wèi)禽類、鳥類、兩栖類或更低(dī)級生(shēng)物的抗凝血液，其紅細胞為(wèi)有(yǒu)核細胞，因此處理(lǐ)量5-20μl，可(kě)加緩沖液BB補足到200μl後進行(xíng)後續步驟。
2、加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鍾。溶液應變清亮（但(dàn)顔色偏黑(hēi)色）。
可(kě)選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多(duō)，需要去除RNA，可(kě)以在加入200μl 結合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鍾。
平衡液BS預處理(lǐ)吸附柱備用：
使用平衡液BS預處理(lǐ)矽膠膜吸附柱為(wèi)必做(zuò)步驟，具體(tǐ)方法參見前文“關于平衡液BS的使用”
3、冷卻後加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可(kě)能會(huì)出現絮狀沉澱。
上(shàng)述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低(dī)産量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可(kě)以渦旋振蕩15秒(miǎo)混勻。
4、将上(shàng)一步混合物（包括可(kě)能有(yǒu)的沉澱）加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管中）13,000 rpm離心30-60秒(miǎo)，倒掉收集管中的廢液。
5、加入500μl抑制(zhì)物去除液IR，12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄廢液。
6、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。
7、加入600μl漂洗液WB，12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。
8、将吸附柱DA放回空(kōng)收集管中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。
9、取出吸附柱DA，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中預熱效果更好）， 室溫放置3-5分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鍾，12,000 rpm離心1分鍾。
洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要DNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于50μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)DNA洗脫效率，減少(shǎo)DNA産量。
10、DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。
9/附錄（以300μl，1ml全血舉例紅細胞裂解操作(zuò)）：
1、吸取900μl紅細胞裂解液到一個(gè)1.5ml離心管或者3ml紅細胞裂解液到一個(gè)15ml離心管。（紅細胞裂解液可(kě)向本公司購買）
2、将抗凝全血（使用前回複到室溫）颠倒混勻後，吸取300μl全血和(hé)1ml全血分别加到上(shàng)述1.5ml和(hé)15ml離心管中，颠倒6-8次，并倒置輕彈管壁，确保充分混勻。
3、室溫放置10分鍾（期間(jiān)應該颠倒輕彈混勻數(shù)次，幫助裂解紅細胞）。
4、12,000 rpm離心20秒(miǎo)（對于1.5ml離心管）或2,000-3,000 rpm離心5分鍾（對于15ml離心管），倒棄紅色上(shàng)清，并小(xiǎo)心的盡可(kě)能多(duō)的吸棄上(shàng)清（注意不要吸到管底的細胞團），留下完整的管底白細胞團和(hé)大(dà)約10μl的殘留上(shàng)清。
離心後在管底應該見到白色的白細胞團，也可(kě)能有(yǒu)一些(xiē)紅細胞殘片和(hé)白細胞團在一起，但(dàn)是如果看到的是大(dà)部分的紅色細胞團，說明(míng)紅細胞裂解很(hěn)不充分，應該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團後重複步驟3，4。
5、加入200μl緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細胞團，充分分散白細胞團。
其中由于肝素抗凝血的白細胞沉澱團很(hěn)難打散重懸，影(yǐng)響後續實驗裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液标本。
6、現在可(kě)以按照操作(zuò)步驟提取全血基因組DNA了。
10/問題與解決方案
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問題
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評論與建議
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标本中
含有(yǒu)血凝塊
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*不恰當的存放标本，未充分混勻，未使用合适的抗凝劑
-建議：丢棄有(yǒu)血凝塊的标本，重新用EDTA，肝素，檸檬酸劑收集血液。
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紅細胞裂解
不完全
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*血液标本裂解前沒有(yǒu)回複到室溫
-建議：處理(lǐ)前先把血液标本回複到室溫。
*裂解時(shí)間(jiān)不夠
-建議：可(kě)延長裂解時(shí)間(jiān)至15分鍾以上(shàng)。
*裂解過程中沒有(yǒu)混勻
-建議：裂解過程中可(kě)以更多(duō)次颠倒混勻，或者輕彈管壁幫助裂解。
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DNA産量低(dī)
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*血液标本中本身含有(yǒu)的白細胞數(shù)量低(dī)
-建議：增加起始血液處理(lǐ)量。
*血液标本存放時(shí)間(jiān)太長
-建議：存放在4℃的血液标本超過5天的産量可(kě)能大(dà)大(dà)降低(dī)，因此不要存放太久。
*蛋白酶K失效了
-建議：收到蛋白酶K後，按照每次使用量分裝凍存，避免反複凍融。
*裂解不完全或者和(hé)異丙醇沒有(yǒu)充分混勻
-建議：加入結合液後，和(hé)加入蛋白酶K後立即吹打或者渦旋混勻；加入異丙醇後立即吹打或者渦旋混勻才加入吸附柱，如果太粘稠必須渦旋振蕩15秒(miǎo)充分混勻。
*洗脫效率不高(gāo)
-建議：确保做(zuò)了步驟8，否則殘留乙醇會(huì)影(yǐng)響洗脫效率，仔細閱讀仔細閱讀注意事項6和(hé)步驟9和(hé)隻使用洗脫緩沖液EB洗脫。
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DNA下遊酶切
不能切開(kāi)或者
酶切不完全
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*忘記做(zuò)步驟8，乙醇抑制(zhì)了酶切反應
-建議：做(zuò)步驟8，然後空(kōng)氣中晾幾分鍾，讓殘留乙醇揮發。
*一些(xiē)矽基質膜成分一起洗脫下來(lái)，抑制(zhì)了酶切反應
-建議：将洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鍾，小(xiǎo)心取上(shàng)清使用。
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DNA長度
小(xiǎo)于15kb
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*血液樣品太老或者不正确的存放，造成DNA降解
-建議：選用新鮮的血液樣品
*操作(zuò)不當，造成對基因組DNA的剪切
-建議：混勻時(shí)不可(kě)太劇(jù)烈，不可(kě)以用手劇(jù)烈振蕩離心管，選用大(dà)口徑的槍頭轉移或者混勻DNA。
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A260吸光值
異常偏高(gāo)
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*一些(xiē)矽基質膜成分一起洗脫下來(lái)，幹擾了吸光值
-建議：将洗脫的基因組DNA溶液13,000rpm再離心一分鍾，小(xiǎo)心取上(shàng)清使用。
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洗脫下來(lái)的
DNA溶液還(hái)帶有(yǒu)輕微的顔色
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*漂洗不完全
-建議：1. 漂洗，直到離心下來(lái)的液體(tǐ)沒有(yǒu)顔色；2. 将洗脫液當成起始材料，再重複一遍實驗，注意略去蛋白酶K消化和(hé)70℃孵育步驟。
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