小(xiǎo)量全血基因組DNA提取試劑盒(溶液型)
DE103
50次、100次、200次
适用于快速提取各種動物全血基因組DNA
規格 價格
50次×0.3ml ¥420
100次×0.3ml ¥675
200次×0.3ml ¥1216

1/适用範圍:

适用于快速提取各種動物全血基因組DNA。

 

 

2/試劑盒組成、儲存、穩定性:

 

試劑盒組成

保存

50次×0.3ml

(DE103-01)

100次×0.3ml

DE103-02

200次×0.3ml

DE103-03

10x紅細胞裂解液RLB

室溫

5 ml

10 ml

20 ml

細胞核裂解液NLS

室溫

15 ml

30 ml

60 ml

蛋白沉澱液PPS

室溫

5 ml

10 ml

20 ml

DNA溶解液DS

室溫

10 ml

20 ml

20 ml

本試劑盒在室溫儲存18個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

 

 

3/儲存事項:

① 環境溫度低(dī)時(shí)細胞核裂解液NLS中某些(xiē)去污劑成份會(huì)析出出現渾濁或者沉澱,可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾,即可(kě)恢複澄清,不要劇(jù)烈搖晃,以免形成過量的泡沫。

② 蛋白沉澱液PPS可(kě)能出現析出和(hé)沉澱,可(kě)以在37℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解,如果不能完全溶解,也不影(yǐng)響使用效果,直接取用上(shàng)層溶液即可(kě)。

③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化,各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

 

 

4/産品介紹:

本試劑盒根據全血特點采用幾個(gè)快速步驟提取基因組DNA。首先紅細胞裂解液RLB裂解去除不含DNA的紅細胞,細胞核裂解液NLS裂解白細胞釋放出基因組DNA, 然後蛋白沉澱液PPS選擇性沉澱去除蛋白,最後純淨的基因組DNA通(tōng)過異丙醇沉澱并重溶解于DNA溶解液。

 

 

5/産品特點:

① 從十幾個(gè)配方中優選出的紅細胞裂解液RLB配方,裂解快速完全。

② 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑。

③ 快速、簡捷,單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在30分鍾內(nèi)完成。

④ 結果穩定,産量高(gāo)(典型的産量300µl全血可(kě)提取出4-15µg),OD260/OD280典型的比值達1.7~1.9,長度可(kě)達50Kb-150kb,可(kě)直接用于構建文庫、PCR、Southern-blot和(hé)各種酶切反應。

 

 

6/注意事項

① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成,使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的傳統台式離心機。

② 用戶需自備異丙醇和(hé)70%乙醇。

③ 典型的産量300µl全血可(kě)提取出5-15µg 基因組DNA(不同樣品尤其疾病樣品中白細胞數(shù)量差異可(kě)能非常大(dà),因此産量的個(gè)體(tǐ)差異也可(kě)能非常大(dà))。

④ 本試劑盒為(wèi)溶液型,可(kě)以很(hěn)容易的按照比例擴大(dà)或者縮小(xiǎo)每次處理(lǐ)的全血量(20µl-10ml),請(qǐng)聯系我們索取其它處理(lǐ)量的操作(zuò)手冊。

⑤ 本試劑盒可(kě)運用于多(duō)種抗凝劑的全血,如EDTA、檸檬酸、肝素抗凝血。其中由于肝素抗凝血的白細胞沉澱團很(hěn)難打散重懸,影(yǐng)響裂解效果,建議選用非肝素的抗凝劑收集血液标本。

⑥ 為(wèi)了最佳效果,最好使用新鮮血液标本或者4℃存放小(xiǎo)于3天的标本,不要使用反複凍融超過3次的标本,否則會(huì)嚴重降低(dī)産量。

 

 

7/操作(zuò)步驟:(實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項)

1、吸取900μl 1x紅細胞裂解液RLB(需要先稀釋到1x)到一個(gè)1.5ml離心管。

注意:使用前應該用去離子水(shuǐ)将10x紅細胞裂解液RLB稀釋10倍到1x

2、将抗凝全血(使用前回複到室溫)颠倒混勻後,吸取300μl加到上(shàng)步裝有(yǒu)紅細胞裂解液RLB的離心管中,颠倒6-8次,并倒置輕彈管壁,确保充分混勻。

3、室溫放置10分鍾(期間(jiān)應該颠倒輕彈,混勻數(shù)次幫助裂解紅細胞)。

4、12,000rpm離心20秒(miǎo),倒棄紅色上(shàng)清,并小(xiǎo)心的盡可(kě)能多(duō)的吸棄上(shàng)清(注意不要吸到管底的細胞團),留下完整的管底白細胞團和(hé)大(dà)約10μl的殘留上(shàng)清。

離心後在管底應該見到白色的白細胞團,也可(kě)能有(yǒu)一些(xiē)紅細胞殘片和(hé)白細胞團在一起,但(dàn)是如果看到的是大(dà)部分的紅色細胞團,說明(míng)紅細胞裂解很(hěn)不充分,應該再加入900μl紅細胞裂解液RLB重懸細胞團後重複步驟3,4。

5、渦旋振蕩直到白細胞團充分重懸、分散。

白細胞的重懸分散對下一步裂解非常重要,白細胞未打散就加入細胞核裂解液NLS,會(huì)導緻白細胞不能充分裂解,形成肉眼可(kě)見團塊。

6、加入300μl細胞核裂解液NLS到重懸的白細胞,上(shàng)下吹打裂解白細胞,或者劇(jù)烈渦旋10秒(miǎo)幫助裂解白細胞。

7、可(kě)選步驟,一般不需要: 在裂解物中加入RNase A(10mg/ml)至終濃度30μg/ml,颠倒25次混勻,37℃溫育15分鍾去除殘留RNA,然後冷卻回室溫。

8、加入100μl蛋白沉澱液PPS後,在渦旋振蕩器(qì)上(shàng)高(gāo)速連續振蕩混勻25秒(miǎo)。混勻後可(kě)能見到一些(xiē)小(xiǎo)的蛋白團塊。

9、13,000rpm離心5分鍾。這時(shí)候應該可(kě)以見到管底暗褐色的蛋白沉澱,也可(kě)能見到一些(xiē)蛋白沉澱漂浮在液體(tǐ)表面。

10、小(xiǎo)心吸取上(shàng)清(大(dà)約300μl)到一個(gè)新的1.5ml離心管中。

吸取上(shàng)清時(shí),注意不要吸到管底和(hé)漂浮在液體(tǐ)表面的蛋白沉澱。如果不小(xiǎo)心将蛋白沉澱轉入新的離心管中,可(kě)再次離心2分鍾後取上(shàng)清。 

11、加入等體(tǐ)積的室溫異丙醇(300μl),輕柔颠倒30次混勻或者直到出現棉絮狀(絲狀)白色DNA沉澱。

12、12,000rpm離心1分鍾,在管底可(kě)以見到白色的DNA沉澱塊,倒棄上(shàng)清。

13、加入1ml70%乙醇,颠倒幾次漂洗DNA沉澱,12,000rpm離心1分鍾, 倒去上(shàng)清(注意不要把DNA沉澱倒掉了),倒置後在吸水(shuǐ)紙上(shàng)輕敲幾下以控幹殘留乙醇,還(hái)可(kě)以用槍頭小(xiǎo)心吸掉管底沉澱周圍和(hé)管壁的殘留乙醇,空(kōng)氣晾幹沉澱幾分鍾。

注意不要幹燥過頭,否則DNA極其難溶;也不能殘留太多(duō)乙醇,否則乙醇可(kě)能抑制(zhì)下遊如酶切反應。

14、加入100μlDNA溶解液DS重新溶解DNA沉澱,輕彈管壁混勻,可(kě)以放置在65℃溫育30-60分鍾(不要超過一小(xiǎo)時(shí)),期間(jiān)不時(shí)的輕彈管壁幫助重新水(shuǐ)化DNA。也可(kě)以在室溫或者4℃放置過夜來(lái)重新水(shuǐ)化DNA。

15、DNA可(kě)以存放在2-8℃,如果要長時(shí)間(jiān)存放,可(kě)以放置在-20℃。

 

 

8/問題與解決方法

問題

評論與建議

标本中
含有(yǒu)血凝塊

*不恰當的存放标本,未充分混勻,未使用合适的抗凝劑

-建議:丢棄有(yǒu)血凝塊的标本,重新用EDTA,肝素,檸檬酸抗凝劑收集血液。

紅細胞裂解
不完全

*血液标本裂解前沒有(yǒu)回複到室溫

-建議:處理(lǐ)前先把血液标本回複到室溫。

*裂解時(shí)間(jiān)不夠

-建議:可(kě)延長裂解時(shí)間(jiān)至15分鍾以上(shàng)。

*沒有(yǒu)充分混勻

-建議:裂解過程中可(kě)以更多(duō)次颠倒混勻,或者輕彈管壁幫助裂解。

DNA産量低(dī)

*血液标本中本身含有(yǒu)的白細胞數(shù)量低(dī)

-建議:增加起始血液處理(lǐ)量。

*白細胞裂解不完全

-建議:仔細閱讀步驟6的操作(zuò)要領。加入裂解液之前,必須劇(jù)烈渦旋振蕩,打散重懸白細胞沉澱團塊,否則很(hěn)難裂解完全。如果是肝素抗凝的血樣,白細胞團塊很(hěn)難打散,加入裂解液後應該在65℃溫育幫助裂解直到看不見細胞團塊。白細胞數(shù)量太大(dà)超出裂解能力,适當增加細胞核裂解液NLS體(tǐ)積。

*血液标本存放時(shí)間(jiān)太長

-建議:存放在4℃的血液标本超過5天的産量可(kě)能大(dà)大(dà)降低(dī),因此不要存放太久。

* DNA沉澱在洗滌的時(shí)候丢失了

-建議:異丙醇沉澱後用乙醇洗滌的過程中,倒棄上(shàng)清的時(shí)候要格外小(xiǎo)心,不要把DNA沉澱也倒掉了。

DNA長度
小(xiǎo)于20kb

*血液樣品太老或者不正确的存放,造成DNA降解

-建議:選用新鮮的血液樣品。。

*操作(zuò)不當,造成對基因組DNA的剪切

-建議:混勻輕柔,不可(kě)以用手劇(jù)烈振蕩離心管,選用大(dà)口徑的槍頭轉移或者混勻DNA。 

未見到蛋白沉澱

*加入蛋白沉澱液PPS前,裂解混合物沒有(yǒu)冷卻回室溫

-建議:冷卻至室溫或者冰上(shàng)放置5分鍾後再加入蛋白沉澱液PPS。

*蛋白沉澱液PPS沒有(yǒu)和(hé)裂解混合物充分混勻

-建議:應該連續高(gāo)速渦旋振蕩混勻25秒(miǎo),渦旋并不會(huì)剪切斷DNA。

A260/A280 <1.6

*污染有(yǒu)蛋白質

-建議:看看上(shàng)述“未見到蛋白沉澱”問題的評論與建議,确保蛋白通(tōng)過沉澱去除。另外請(qǐng)參見步驟10,防止蛋白污染。

*測定吸光值時(shí)用水(shuǐ)稀釋DNA 會(huì)降低(dī)A260/A280

-建議:使用TE緩沖液來(lái)稀釋DNA,保證pH值大(dà)于8.0。

DNA沉澱難以
重新溶解水(shuǐ)化

*晾幹DNA沉澱時(shí)過度了

-建議:晾幹時(shí)密切觀察,不要幹燥過頭,注意應該觀察管底的DNA沉澱,有(yǒu)時(shí)候管壁上(shàng)的殘留乙醇已經揮發,但(dàn)留下一些(xiē)水(shuǐ)分還(hái)沒有(yǒu)幹,隻要管底DNA幹了就可(kě)以加入DNA 溶解液。可(kě)在65℃溫育幫助重新溶解(不要超過一小(xiǎo)時(shí))然後室溫或者4℃放置過夜,期間(jiān)可(kě)以颠倒輕彈幫助溶解。

下遊酶切切不開(kāi)

* DNA未幹燥完全,殘留乙醇太多(duō)

-建議:敞開(kāi)離心管口,在65℃溫育幾分鍾,讓乙醇揮發。