1/适用範圍：

适用于快速提取各種動植物細胞/組織基因組DNA。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項:

① 環境溫度低(dī)時(shí)細胞核裂解液NLS中某些(xiē)去污劑成份會(huì)析出出現渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，輕輕旋搖，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

② 蛋白沉澱液PPS可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在37℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影(yǐng)響使用效果，直接取用上(shàng)層溶液即可(kě)。

③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

本試劑盒用于快速的從動植物細胞/組織中提取基因組DNA。樣品研磨或者勻漿後加入細胞核裂解液NLS，首先在強去污劑或者和(hé)蛋白酶K協同作(zuò)用下裂解細胞釋放出基因組DNA，接着加入RNase A去除RNA，然後蛋白沉澱液PPS選擇性沉澱去除蛋白，最後純淨的基因組DNA通(tōng)過異丙醇沉澱并重溶解于DNA溶解液。

5/産品特點：

① 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚、氯仿等試劑。

② 快速，簡捷，組織樣品操作(zuò)整個(gè)過程可(kě)在1個(gè)小(xiǎo)時(shí)內(nèi)完成。

③ 結果穩定，産量高(gāo)（比離心柱型的産量高(gāo)一倍以上(shàng)），OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可(kě)達50kb-150kb，可(kě)直接用于PCR，Southern-blot和(hé)各種酶切反應以及文庫構建。

6/注意事項

① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到3,000xg，可(kě)容納50ml離心管的台式離心機。

② 用戶需自備異丙醇、70％乙醇、PBS(用于細胞)、液氮研缽/或勻漿器(qì)(用于組織)、水(shuǐ)浴箱。

③ 開(kāi)始實驗前将需要的水(shuǐ)浴先預熱好備用。

④ 本試劑盒為(wèi)溶液型，可(kě)以很(hěn)容易的按照比例擴大(dà)或者縮小(xiǎo)每次處理(lǐ)的組織細胞量，請(qǐng)聯系我們索取其它處理(lǐ)量的操作(zuò)手冊。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

1、組織培養細胞

a、收集6-8×107個(gè)細胞到一個(gè)50 ml離心管；對于貼壁細胞，應該先用胰蛋白酶消化後吹打下來(lái)收集。

b、500 x g離心5分鍾，使細胞沉澱下來(lái)。棄上(shàng)清，留下細胞團和(hé)大(dà)約100μl殘留的液體(tǐ)。

c、加3 ml PBS重懸洗滌細胞，重複上(shàng)一步驟，高(gāo)速渦旋振蕩重懸細胞團。

d、對于細胞核裂解液NLS裂解效果不好的細胞系（例如PC12細胞），在做(zuò)下一步驟前，應該做(zuò)幾次凍融循環：凍于液氮後，在95℃水(shuǐ)浴融化，重複4次。

e、加入9 ml細胞核裂解液NLS，用大(dà)口徑的槍頭（剪去槍頭尖）輕柔吹打裂解細胞直至看不見細胞團塊(如有(yǒu)必要可(kě)以37℃溫育幫助裂解)。

f、接操作(zuò)步驟項下4。

2、動物組織（例如鼠肝腦(nǎo)）

a、9 ml冰預冷的細胞核裂解液NLS加入300mg新鮮或者解凍的組織，勻漿器(qì)勻漿完全，将裂解物轉入50ml離心管。另一種方法：在液氮中研磨300mg組織成細粉後，轉入裝有(yǒu)9ml 冰預冷細胞核裂解液NLS的50ml離心管， 用大(dà)口徑槍頭吹打混勻。

b、将裂解物放置在65℃水(shuǐ)浴15-60分鍾。

如果需要最大(dà)的産量，可(kě)加入45μl蛋白酶K (20mg/ml)，颠倒25次混勻，55℃水(shuǐ)浴3小(xiǎo)時(shí)或者過夜。直到組織溶解，中間(jiān)不時(shí)颠倒混勻。

c、接操作(zuò)步驟項下4。

3、植物組織

a、在液氮中研磨植物組織（200mg幹組織或400mg濕組織）成細粉後，轉入裝有(yǒu)9ml冰預冷的細胞核裂解液NLS的50 ml離心管， 用大(dà)口徑槍頭吹打混勻。

植物組織起始處理(lǐ)量應該根據葉齡、種類、基因組大(dà)小(xiǎo)調整。

b、将裂解物放置在65℃水(shuǐ)浴15-60分鍾，期間(jiān)至少(shǎo)颠倒10次。

4、加入18μl RNase A（10mg/ml）至裂解物中，即RNase A終濃度30μg/ml，颠倒混勻25次後，37℃溫育15-60分鍾去除殘留RNA。然後室溫冷卻至少(shǎo)5分鍾或者冰浴使回複到室溫。

5、在回複到室溫的裂解物內(nèi)加入3ml蛋白沉澱液PPS，在渦旋振蕩器(qì)上(shàng)高(gāo)速連續振蕩混勻25秒(miǎo)。混勻後可(kě)能見到一些(xiē)小(xiǎo)的蛋白團塊。冰浴5分鍾。

由于樣品體(tǐ)積重量小(xiǎo)，用渦旋振蕩器(qì)振蕩混勻産生(shēng)的剪切力并不會(huì)剪切打斷基因組DNA。如果用手振蕩混勻，則不可(kě)以用手上(shàng)下劇(jù)烈振蕩混勻，隻能适當力度振蕩混勻，否則會(huì)剪斷基因組DNA； 但(dàn)是力度也不能太小(xiǎo)，要保證充分混勻，将粘稠的裂解物打散開(kāi)，否則DNA無法和(hé)蛋白質沉澱分離開(kāi)， 離心時(shí)會(huì)和(hé)蛋白質一起沉澱下來(lái)，造成DNA丢失或者降低(dī)産量。此外混勻不充分也可(kě)能造成蛋白沉澱不充分，最後的産物污染有(yǒu)較大(dà)量的蛋白質。因此建議用渦旋振蕩器(qì)。

6、2,500xg(可(kě)根據需要調整加大(dà)離心力)離心10分鍾。這時(shí)應該可(kě)以見到管底蛋白沉澱，也可(kě)能見到一些(xiē)蛋白沉澱漂浮在液體(tǐ)表面。

7、小(xiǎo)心緩慢吸取上(shàng)清到一個(gè)新的50ml離心管中，不要吸到沉澱。

吸取上(shàng)清時(shí)，注意不要吸到管底的和(hé)漂浮在液體(tǐ)表面的蛋白沉澱。如果不小(xiǎo)心将蛋白沉澱轉入新的離心管中，可(kě)再次離心2分鍾後取上(shàng)清。

8、加入等體(tǐ)積的室溫異丙醇（約9ml），颠倒30次混勻或者直到出現棉絮狀（絲狀）白色DNA沉澱。

注意：颠倒混勻的時(shí)候，棉絮狀（絲狀）DNA有(yǒu)時(shí)會(huì)粘附着在蓋子或者管口處，即使颠倒也不跟下來(lái)，這樣導緻操作(zuò)者看不到沉澱，誤認為(wèi)沒有(yǒu)得(de)到DNA。解決辦法是略去步驟9，直接2,000xg離心3-5分鍾，棄上(shàng)清，然後接步驟11。

9、垂直放置離心管，讓白色DNA沉澱自然沉到管底，然後盡可(kě)能多(duō)的吸棄上(shàng)清，注意不要吸到沉澱。

如果棉絮狀（絲狀）DNA沉澱附着有(yǒu)氣泡，則會(huì)漂浮在液體(tǐ)表面，而不會(huì)沉澱下來(lái)，要小(xiǎo)心避開(kāi)沉澱吸取上(shàng)清，不要把沉澱給吸掉了。

10、加入70％乙醇9ml後，颠倒幾次漂洗DNA沉澱，2,000xg離心3-5分鍾，在管底可(kě)以見到白色的DNA沉澱塊，倒棄上(shàng)清。

11、加入70％乙醇5ml ，颠倒幾次漂洗DNA沉澱，2,000xg離心1分鍾， 倒去上(shàng)清（注意不要把DNA沉澱倒掉了），倒置後在吸水(shuǐ)紙上(shàng)輕敲幾下以控幹殘留乙醇，還(hái)可(kě)以用槍頭小(xiǎo)心吸掉管底沉澱周圍和(hé)管壁的殘留乙醇，空(kōng)氣晾幹沉澱幾分鍾。

注意不要幹燥過頭，否則DNA極其難溶；也不能殘留太多(duō)乙醇，否則乙醇可(kě)能抑制(zhì)下遊如酶切反應。

12、加入500μl DNA溶解液DS重新水(shuǐ)化溶解DNA沉澱，輕彈管壁混勻，可(kě)以放置在65℃溫育60分鍾（不要超過一小(xiǎo)時(shí)），也可(kě)以在室溫或者4℃放置過夜來(lái)重新水(shuǐ)化DNA，中間(jiān)不時(shí)的輕彈管壁幫助重新水(shuǐ)化DNA。

13、DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。

8/問題與解決方法