1/适用範圍：

适用于快速提取全血、各種動植物組織細胞基因組DNA。 

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項：

① 裂解液TL、結合液CB、或者抑制(zhì)物去除液IR低(dī)溫時(shí)可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在37℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解，恢複澄清透明(míng)後冷卻到室溫即可(kě)使用。

② 為(wèi)避免降低(dī)活性，方便運輸，提供蛋白酶K為(wèi)凍幹粉狀，收到後，可(kě)短(duǎn)暫離心後，加入1毫升滅菌水(shuǐ)溶解。因為(wèi)反複凍融可(kě)能會(huì)降低(dī)酶活性，因此溶解後立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。

③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中發生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞內(nèi)核酸酶，然後基因組DNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的， 抑制(zhì)物去除液和(hé)漂洗液将細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最後低(dī)鹽的洗脫緩沖液将純淨基因組DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

① 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉澱等。

② 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在30分鍾內(nèi)完成。

③ 多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，典型的産量200µl全血可(kě)提取出3-6µg，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可(kě)達30 kb -50kb，可(kě)直接用于PCR、Southern-blot和(hé)各種酶切反應。

④ 從十幾個(gè)配方中優選出的紅細胞裂解液配方，裂解快速完全，客戶可(kě)根據需要選擇購買。

⑤ 典型的産量200µl全血可(kě)提取出3-6µg 基因組DNA。

6/注意事項：

① 所有(yǒu)的離心均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

② 需要自備1XPBS(磷酸鹽緩沖液)和(hé)異丙醇。

③ 不同樣品尤其疾病樣品中白細胞數(shù)量差異可(kě)能非常大(dà)，因此産量的個(gè)體(tǐ)差異也可(kě)能非常大(dà)。

④ 開(kāi)始實驗前将需要的水(shuǐ)浴先預熱到70℃備用。

⑤ 為(wèi)了最佳效果，最好使用新鮮血液标本或者4℃存放少(shǎo)于3天的标本，不要使用反複凍融超過3次的标本，否則會(huì)嚴重降低(dī)産量。

7/關于平衡液BS的使用

介紹：核酸吸附矽膠膜柱子長期放置過程中會(huì)同空(kōng)氣中的電(diàn)荷/塵埃發生(shēng)反應而影(yǐng)響其核酸的結合能力。矽膠柱經平衡液BS預處理(lǐ)後可(kě)大(dà)大(dà)減少(shǎo)柱子中矽膠膜的憎水(shuǐ)基團，提高(gāo)核酸的結合能力。從而提高(gāo)矽膠柱子回收效率或者産量。平衡液BS是強堿性溶液，若不小(xiǎo)心碰到，請(qǐng)用大(dà)量自來(lái)水(shuǐ)清洗。用完後需蓋緊瓶蓋，以免接觸空(kōng)氣。室溫保存。在保存過程中可(kě)能有(yǒu)沉澱生(shēng)成，請(qǐng)加熱至37℃使沉澱完全消失。

使用方法：（臨用前才預處理(lǐ)）取一個(gè)新的矽膠膜吸附柱裝在收集管CT中，吸取100μl的平衡液BS至柱子中。13000 rpm離心1分鍾，倒掉收集管CT中廢液，将吸附柱子重新放回收集管CT。此時(shí)平衡液BS預處理(lǐ)柱子完畢。接後續的操作(zuò)步驟。

8/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

平衡液BS預處理(lǐ)吸附柱備用：

使用平衡液BS預處理(lǐ)矽膠膜吸附柱為(wèi)必做(zuò)步驟，具體(tǐ)方法參見前文“關于平衡液BS的使用”

1、全血

a、取200ul新鮮、冷凍或加入各種抗凝劑的血液，放入1.5ml離心管。

如果全血起始量小(xiǎo)于200μl，則用緩沖液BB補足到200μl。如果起始量介于200μl-300μl之間(jiān)，則後續操作(zuò)需要按照比例增加試劑用量。如果起始量介于300μl-1ml之間(jiān)，則需要先進行(xíng)紅細胞裂解操作(zuò)（見本說明(míng)書(shū)後附錄）。

如果處理(lǐ)血樣為(wèi)禽類、鳥類、兩栖類或更低(dī)級生(shēng)物的抗凝血液，其紅細胞為(wèi)有(yǒu)核細胞，因此處理(lǐ)量5-20μl，可(kě)加緩沖液BB補足到200μl後進行(xíng)後續步驟。

b、加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鍾。溶液應變清亮（但(dàn)顔色偏黑(hēi)色）。

可(kě)選步驟，一般不需要: 如果RNA殘留較多(duō)，需要去除RNA，可(kě)以在加入200μl 結合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鍾。

c、冷卻後加100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可(kě)能會(huì)出現絮狀沉澱。

上(shàng)述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低(dī)産量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可(kě)以渦旋振蕩15秒(miǎo)混勻。

d、将上(shàng)一步所得(de)溶液和(hé)絮狀沉澱都加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管CT中）13,000 rpm離心60秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。

e、接操作(zuò)步驟項下5。

2、組織培養細胞

a、收集約105-106懸浮細胞到一個(gè)1.5ml離心管；對于貼壁細胞，應該先用胰蛋白酶消化後吹打下來(lái)收集。

b、13,000rpm離心10秒(miǎo)，使細胞沉澱下來(lái)。棄上(shàng)清，留下細胞團和(hé)大(dà)約10-20μl殘留的液體(tǐ)。

c、加200μl 1XPBS重懸洗滌細胞，13,000rpm離心10秒(miǎo)，使細胞沉澱下來(lái)。完全吸棄上(shàng)清, 将細胞沉澱重懸于180μl 1XPBS中。

d、加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鍾。

可(kě)選做(zuò)步驟: 如果RNA殘留較多(duō)，需要去除RNA，可(kě)以在加入200μl 結合液CB 前加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鍾。

e、冷卻後加100μl異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可(kě)能會(huì)出現絮狀沉澱。

f、将上(shàng)一步混合物（包括可(kě)能有(yǒu)的沉澱）加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管CT中）13,000rpm離心60秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。

g、接操作(zuò)步驟項下5。

3、動植物組織（例如鼠肝腦(nǎo)或者植物葉片）

a、将20-50mg新鮮或者解凍的組織用解剖刀切成小(xiǎo)碎塊（切成小(xiǎo)塊可(kě)以提高(gāo)産量）或者在液氮中研磨組織成細粉後，轉入裝有(yǒu)180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中， 用大(dà)口徑槍頭吹打混勻。

b、加入20μl的蛋白酶K溶液(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。

c、将裂解物放置在55℃水(shuǐ)浴1-3小(xiǎo)時(shí)或者直到組織消化完全，期間(jiān)輕柔的振蕩幾次幫助裂解。

可(kě)選做(zuò)步驟: 如果RNA殘留較多(duō)，需要去除RNA，可(kě)在完成步驟c後加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鍾。

d、加入200μl 結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，70℃放置10分鍾。

e、冷卻後加100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可(kě)能會(huì)出現絮狀沉澱。

f、用1ml的槍頭吸取混合物，将混合物加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管CT中）13,000rpm離心60秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。

如果有(yǒu)不溶組織物可(kě)能堵住槍頭，可(kě)将槍頭在吸水(shuǐ)紙上(shàng)輕蹭去除不溶物；如果吸上(shàng)來(lái)的混合物少(shǎo)則可(kě)以将槍頭和(hé)不溶物一起棄去，該做(zuò)法是為(wèi)了去除不溶物，以免堵塞離心柱。

g、接操作(zuò)步驟項下5。

4、動物組織（鼠尾）

a、将0.2-0.5cm的鼠尾巴尖(即20-50mg)剪碎（一定要剪0-2cm範圍內(nèi)的尾巴尖，否則裂解效果不好），或者在液氮中研磨組織成細粉後，轉入裝有(yǒu)180μl組織裂解液TL的1.5ml離心管中， 用大(dà)口徑槍頭吹打混勻。

b、加入20μl的蛋白酶K(20mg/ml)，立刻渦旋振蕩充分混勻。

c、将裂解物放置在55℃水(shuǐ)浴3小(xiǎo)時(shí)或者直到組織消化完全，期間(jiān)輕柔的振蕩幾次幫助裂解。

可(kě)選做(zuò)步驟: 如果RNA殘留較多(duō)，需要去除RNA，可(kě)在完成步驟c後加20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鍾。

d、用一個(gè)1ml不帶針頭的一次性輸液器(qì)抽打裂解物2-3次。

e、加入200μl 結合液CB和(hé)100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻。

f、13,000rpm 離心5分鍾，将上(shàng)清加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管CT中）13,000rpm離心30-60秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。

g、接操作(zuò)步驟項下5。

上(shàng)述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低(dī)産量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可(kě)以渦旋振蕩15秒(miǎo)混勻。

5、加入500μl抑制(zhì)物去除液IR，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄廢液。

6、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

7、加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

8、将吸附柱DA放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

9、取出吸附柱DA，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加100μl洗脫緩沖液EB （洗脫緩沖液事先在65-70℃水(shuǐ)浴中預熱）， 室溫放置3-5分鍾，12,000rpm 離心1分鍾。将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鍾，12,000rpm離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要DNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于50μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)DNA洗脫效率，減少(shǎo)DNA産量。

10、DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在-20℃。

9/附錄（以300μl，1ml全血舉例紅細胞裂解操作(zuò)）：

1、吸取900μl紅細胞裂解液到一個(gè)1.5ml離心管或者3ml紅細胞裂解液到一個(gè)15ml離心管。（紅細胞裂解液可(kě)向本公司購買）

2、将抗凝全血（使用前回複到室溫）颠倒混勻後，吸取300μl全血和(hé)1ml全血分别加到上(shàng)述1.5ml和(hé)15ml離心管中，颠倒6-8次，并倒置輕彈管壁，确保充分混勻。

3、室溫放置10分鍾（期間(jiān)應該颠倒輕彈混勻數(shù)次，幫助裂解紅細胞）。

4、12,000 rpm離心20秒(miǎo)（對于1.5ml離心管）或2,000-3,000 rpm離心5分鍾（對于15ml離心管），倒棄紅色上(shàng)清，并小(xiǎo)心的盡可(kě)能多(duō)的吸棄上(shàng)清（注意不要吸到管底的細胞團），留下完整的管底白細胞團和(hé)大(dà)約10μl的殘留上(shàng)清。

離心後在管底應該見到白色的白細胞團，也可(kě)能有(yǒu)一些(xiē)紅細胞殘片和(hé)白細胞團在一起，但(dàn)是如果看到的是大(dà)部分的紅色細胞團，說明(míng)紅細胞裂解很(hěn)不充分，應該再加入紅細胞裂解液重懸細胞團後重複3，4。

5、加入200μl緩沖液BB渦旋振蕩重懸白細胞團，充分分散白細胞團。

其中由于肝素抗凝血的白細胞沉澱團很(hěn)難打散重懸，影(yǐng)響後續實驗裂解效果，建議選用非肝素的抗凝劑收集血液标本。

6、現在可(kě)以按照操作(zuò)提取全血基因組DNA了。

10/問題與解決方法