1/适用範圍：

适用于快速提取各種細菌基因組DNA。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項:

① 結合液CB或者抑制(zhì)物去除液IR低(dī)溫時(shí)可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在37℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解，恢複澄清透明(míng)後冷卻到室溫即可(kě)使用。

② 為(wèi)避免降低(dī)活性，方便運輸，提供蛋白酶K為(wèi)凍幹粉狀，收到後，可(kě)短(duǎn)暫離心後，加入1毫升滅菌水(shuǐ)溶解，因為(wèi)反複凍融可(kě)能會(huì)降低(dī)酶活性，因此溶解後立即按照每次使用量(20微升)分裝凍存，－20℃保存。

③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

獨特的結合液/蛋白酶K迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞內(nèi)核酸酶，然後基因組DNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜， 再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟，抑制(zhì)物去除液和(hé)漂洗液将細胞代謝物，蛋白等雜質去除， 最後低(dī)鹽的洗脫緩沖液将純淨基因組DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

① 離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用世界著名公司特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。

② 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。

③ 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在30分鍾內(nèi)完成。

④ 多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可(kě)達30kb -50kb，可(kě)直接用于PCR，Southern-blot和(hé)各種酶切反應。

6/注意事項

① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的傳統台式離心機。

② 開(kāi)始實驗前根據需要将水(shuǐ)浴預熱到37℃或者70℃備用。

③ 需要自備異丙醇。

④ 需自備0.5M EDTA、Triton X-100和(hé)Lysozyme（溶菌酶）(用于革蘭氏陽性菌)。

⑤ 結合液CB 和(hé)抑制(zhì)物去除液IR中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚，眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

⑥ 洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA，不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫，但(dàn)應該确保批pH大(dà)于7.5， pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

1、取0.5-2毫升培養菌液（最多(duō)不超過2×109個(gè)細胞），10,000rpm，離心30秒(miǎo)，盡可(kě)能的吸棄上(shàng)清，收集菌體(tǐ)。

起始處理(lǐ)量可(kě)以根據細菌密度、細胞種類、預期産量進行(xíng)調整，但(dàn)是離心吸附柱最大(dà)吸附能力是20μg基因組DNA，如果菌體(tǐ)過量超過最大(dà)吸附能力，反而會(huì)嚴重降低(dī)産量。

2、加入200μl緩沖液RB重懸，10,000rpm離心30秒(miǎo)，棄上(shàng)清。将細胞振蕩或者吹打充分重懸于180μl緩沖液RB中。

注意：對于較難破壁的革蘭氏陽性菌，可(kě)略過第2步驟，加入溶菌酶進行(xíng)破壁處理(lǐ)，具體(tǐ)方法為(wèi)：加入180 μl緩沖液(20 mM Tris, pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2% Triton X-100；臨用前加入終濃度為(wèi)20 mg/ml的溶菌酶(溶菌酶必須用溶菌酶幹粉溶解在緩沖液中進行(xíng)配制(zhì)，否則會(huì)導緻溶菌酶無活性))，37 ℃處理(lǐ)30 min以上(shàng)。

3、加入20μl蛋白酶K (20mg/ml)溶液，充分混勻，再加入200μl 結合液CB，立刻渦旋振蕩充分混勻，在70℃放置10分鍾。

可(kě)選做(zuò)步驟: 如果RNA殘留較多(duō)，需要去除RNA，可(kě)以在加入200μl 結合液CB 前加4μl RNase A(100mg/ml)溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10分鍾。

4、冷卻後加入100μl 異丙醇，立刻渦旋振蕩充分混勻，此時(shí)可(kě)能會(huì)出現絮狀沉澱。

上(shàng)述步驟中立刻渦旋或者吹打充分混勻非常重要，混勻不充分嚴重降低(dī)産量，必要時(shí)如樣品粘稠不易混勻時(shí)可(kě)以渦旋振蕩15秒(miǎo)混勻。

5、将上(shàng)一步混合物（包括可(kě)能有(yǒu)的沉澱）加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管CT中）13,000 rpm離心30-60秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液。

6、加入500μl抑制(zhì)物去除液IR，12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄廢液。

7、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

8、加入600μl漂洗液WB，12,000 rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

9、将吸附柱DA放回空(kōng)收集管CT中，13,000 rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

10、取出吸附柱DA，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中預熱效果更好）， 室溫放置3-5分鍾，12,000 rpm 離心1分鍾。将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鍾，12,000 rpm離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果需要DNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于30μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)DNA洗脫效率，減少(shǎo)DNA産量。

11、DNA可(kě)以存放在2-8℃,如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。

8/問題與解決方法