1/适用範圍：

适用于快速提取植物基因組DNA。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

 本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項:

① 裂解液PB、或者抑制(zhì)物去除液IR低(dī)溫時(shí)可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在55℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解，恢複澄清透明(míng)後冷卻到室溫即可(kě)使用。結合液CL鹽酸胍濃度高(gāo)，加入乙醇後可(kě)能出現一些(xiē)沉澱不影(yǐng)響使用，直接取上(shàng)清用。

② 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

改進的經典CTAB植物DNA抽提液內(nèi)（添加多(duō)種針對植物特點的多(duō)糖、多(duō)酚去除成份）迅速裂解細胞和(hé)滅活細胞內(nèi)核酸酶，氯仿抽提後通(tōng)過離心清除多(duō)糖、多(duō)酚和(hé)蛋白質（根據需要，上(shàng)清中還(hái)加入異丙醇離心沉澱基因組DNA，進一步去除其它各種雜質），然後基因組DNA在高(gāo)離序鹽狀态下選擇性吸附于離心柱內(nèi)矽基質膜，再通(tōng)過一系列快速的漂洗－離心的步驟， 進一步将多(duō)糖、多(duō)酚和(hé)細胞代謝物、蛋白等雜質去除，最後低(dī)鹽的洗脫緩沖液将純淨基因組DNA從矽基質膜上(shàng)洗脫。

5/産品特點：

1. 離心吸附柱內(nèi)矽基質膜全部采用特制(zhì)吸附膜，柱與柱之間(jiān)吸附量差異極小(xiǎo)，可(kě)重複性好。
2. 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑，也不需要乙醇沉澱等步驟。
3. 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在1小(xiǎo)時(shí)內(nèi)完成。
4. 數(shù)種去多(duō)糖、多(duō)酚成份和(hé)多(duō)次柱漂洗确保高(gāo)純度，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可(kě)達30 kb -50kb，可(kě)直接用于PCR，Southern-blot和(hé)各種酶切反應。

6/注意事項

① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000rpm的傳統台式離心機。

② 開(kāi)始實驗前将需要的水(shuǐ)浴先預熱到65℃備用。

③ 需要自備氯仿,無水(shuǐ)乙醇和(hé)β-巯基乙醇。

④ 結合液CL 和(hé)抑制(zhì)物去除液IR中含有(yǒu)刺激性化合物，操作(zuò)時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和(hé)衣服。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大(dà)量清水(shuǐ)或者生(shēng)理(lǐ)鹽水(shuǐ)沖洗。

⑤ 不同來(lái)源的植物組織材料中提取DNA 的量會(huì)有(yǒu)差異，一般100mg新鮮組織典型産量可(kě)達3-25μg。

⑥ 洗脫液EB不含有(yǒu)螯合劑EDTA， 不影(yǐng)響下遊酶切、連接等反應。也可(kě)以使用水(shuǐ)洗脫， 但(dàn)應該确保pH大(dà)于7.5， pH過低(dī)影(yǐng)響洗脫效率。用水(shuǐ)洗脫DNA應該保存在－20℃。DNA如果需要長期保存，可(kě)以用TE緩沖液洗脫 （10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但(dàn)是EDTA可(kě)能影(yǐng)響下遊酶切反應，使用時(shí)可(kě)以适當稀釋。

7/标準操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

提示：

     ● 第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB和(hé)結合液CL中加入指定量的無水(shuǐ)乙醇，充分混勻，加入後請(qǐng)及時(shí)在方框打鈎标記已加入乙醇，以免多(duō)次加入!

     ● 取所需适量裂解液PB放置在65℃預熱，使用前加入β-巯基乙醇到終濃度2%。

1、取适量植物組織（新鮮組織100 mg 或幹重組織30 mg）在研缽中加入液氮充分碾磨成細粉。

2、轉移細粉到一個(gè)1.5ml離心管，不要解凍，加600μl 65℃預熱的裂解液PB (确認已加入β-巯基乙醇至2%)，劇(jù)烈渦旋振蕩混勻，用大(dà)口徑槍頭輕柔吹打幫助裂解。

如果組織裂解困難，可(kě)根據需要加一個(gè)輕柔勻漿10秒(miǎo)的步驟幫助裂解。

3、65℃水(shuǐ)浴20-30分鍾，在水(shuǐ)浴過程中颠倒離心管以混合樣品數(shù)次。

可(kě)選:如果組織幹燥或者産量低(dī)，可(kě)以适當延長水(shuǐ)浴時(shí)間(jiān)。如果RNA殘留多(duō)，可(kě)在水(shuǐ)浴前加入6μl RNA酶（20mg/ml）。

注：如果提取的DNA殘留RNA較多(duō)導緻電(diàn)泳時(shí)候條帶拖尾，條帶扭曲，背景很(hěn)高(gāo)等不正常電(diàn)泳情況，可(kě)以加1% RNA酶（10mg/ml）37℃或者室溫放置半小(xiǎo)時(shí)即可(kě)消化RNA，消化完後不需要特殊處理(lǐ)便可(kě)用于PCR或者酶切。

4、加入700μl氯仿或者氯仿/異戊醇（體(tǐ)積比24：1混合），颠倒充分混勻幾分鍾（或者渦旋混勻），13,000rpm 離心5分鍾。

若提取的植物組織富含多(duō)糖多(duō)酚，可(kě)以在第4步前用等體(tǐ)積酚/氯仿（1：1）抽提一遍。

5、小(xiǎo)心吸取上(shàng)清到一個(gè)新的1.5ml離心管，注意不要吸到界面物質。

如上(shàng)清比較渾濁，則需要重複步驟4一遍，直到得(de)到透亮上(shàng)清。

6、較精确估算(suàn)上(shàng)清量，加入1.5倍體(tǐ)積結合液CL （請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!）後立刻渦旋，充分混勻。此時(shí)可(kě)能出現沉澱，但(dàn)不影(yǐng)響實驗結果。

7、将上(shàng)一步所得(de)混合物（包括可(kě)能出現的沉澱）加入一個(gè)吸附柱DA中，（吸附柱DA放入收集管CT中）13,000rpm離心30秒(miǎo)，倒掉收集管CT中的廢液（先加700μl離心，棄廢液，再加入剩餘的溶液，再次離心）。

8、加入500μl抑制(zhì)物去除液IR，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄廢液。

9、加入600μl漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!），12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

10、加入600μl漂洗液WB，12,000rpm 離心30秒(miǎo)，棄掉廢液。

11、将吸附柱DA放回空(kōng)收集管CT中，13,000rpm離心2分鍾，盡量除去漂洗液， 以免漂洗液中殘留乙醇抑制(zhì)下遊反應。

12、取出吸附柱DA，放入一個(gè)幹淨的離心管中，在吸附膜的中間(jiān)部位加100μl洗脫緩沖液EB（洗脫緩沖液事先在 65-70℃水(shuǐ)浴中預熱），室溫放置3-5分鍾，12,000rpm 離心1分鍾。将得(de)到的溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2分鍾，12,000rpm離心1分鍾。

洗脫體(tǐ)積越大(dà)，洗脫效率越高(gāo)，如果預計(jì)和(hé)需要産量高(gāo)，可(kě)增大(dà)洗脫體(tǐ)積，如果需要DNA濃度較高(gāo)，可(kě)以适當減少(shǎo)洗脫體(tǐ)積， 但(dàn)是最小(xiǎo)體(tǐ)積不應少(shǎo)于50μl，體(tǐ)積過小(xiǎo)降低(dī)DNA洗脫效率，減少(shǎo)DNA産量。

13/DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。

8/附錄（低(dī)DNA含量或者産量低(dī)樣品操作(zuò)步驟）：

1、取适量植物組織（新鮮組織400 mg 或幹重組織200 mg）在研缽中加入液氮充分碾磨成細粉。

2、轉移細粉到一個(gè)15ml離心管，不要解凍，加入9ml 65℃預熱的裂解液PB (确認已經加入β-巯基乙醇至2%)，劇(jù)烈渦旋振蕩混勻，用大(dà)口徑槍頭吹打幫助裂解。

如果組織裂解困難，可(kě)根據需要加一個(gè)輕柔勻漿10秒(miǎo)的步驟幫助裂解。

3、室溫放置60分鍾，中間(jiān)不時(shí)颠倒離心管以混合樣品數(shù)次。

如果組織幹燥或者産量低(dī)，可(kě)以放置在65℃水(shuǐ)浴。

4、加4.5ml氯仿/異戊醇（體(tǐ)積比24：1混合），渦旋充分混勻，3,000g 離心10分鍾。

5、小(xiǎo)心吸取上(shàng)清到一個(gè)新的15ml離心管，注意不要吸到界面物質。重複一遍步驟4。

6、小(xiǎo)心吸取上(shàng)清到一個(gè)新的15ml離心管，估算(suàn)上(shàng)清量，加入0.7倍體(tǐ)積的異丙醇，渦旋混勻來(lái)沉澱DNA。

7、立刻3,000g 離心20分鍾沉澱DNA，棄上(shàng)清，颠倒離心管口放在紙巾上(shàng)控幹殘留液體(tǐ)，并小(xiǎo)心用用移液槍吸幹沉澱周圍殘留液體(tǐ)（不要過于幹燥DNA沉澱）。

8、加入300μl－400μl預熱到65℃的滅菌水(shuǐ)，重新溶解DNA，可(kě)能需要在65℃短(duǎn)暫溫育幫助溶解，期間(jiān)不斷輕彈管底幫助溶解。

9、加入1.5倍體(tǐ)積結合液CL（450μl－600μl，請(qǐng)先檢查是否已加入無水(shuǐ)乙醇!）後立刻渦旋，充分混勻。此時(shí)可(kě)能出現沉澱，但(dàn)不影(yǐng)響實驗結果。

10、後續步驟和(hé)上(shàng)面标準操作(zuò)步驟5開(kāi)始後完全一樣。