1/适用範圍：

适用于快速提取各種細菌基因組DNA。

2/試劑盒組成、儲存、穩定性：

本試劑盒在室溫儲存12個(gè)月不影(yǐng)響使用效果。

3/儲存事項:

① 環境溫度低(dī)時(shí)細胞核裂解液NLS中某些(xiē)去污劑成份會(huì)析出出現渾濁或者沉澱，可(kě)在37℃水(shuǐ)浴加熱幾分鍾，輕輕旋搖，即可(kě)恢複澄清，不要劇(jù)烈搖晃，以免形成過量的泡沫。

② 蛋白沉澱液PPS可(kě)能出現析出和(hé)沉澱，可(kě)以在37℃水(shuǐ)浴幾分鍾幫助重新溶解，如果不能完全溶解，也不影(yǐng)響使用效果，直接取用上(shàng)層溶液即可(kě)。

③ 避免試劑長時(shí)間(jiān)暴露于空(kōng)氣中産生(shēng)揮發、氧化、pH值變化，各溶液使用後應及時(shí)蓋緊蓋子。

4/産品介紹：

本試劑盒用于快速的從各種細菌中提取基因組DNA。細菌樣品加入細胞核裂解液NLS(或者通(tōng)過溶菌酶或者其它一些(xiē)酶幫助裂解細胞壁後)，首先在強去污劑作(zuò)用下裂解細胞釋放出基因組DNA，接着加入RNase A去除RNA，然後蛋白沉澱液PPS選擇性沉澱去除蛋白，最後純淨的基因組DNA通(tōng)過異丙醇沉澱并重溶解于DNA溶解液。

5/産品特點：

① 不需要使用有(yǒu)毒的苯酚等試劑。

② 快速，簡捷，單個(gè)樣品操作(zuò)一般可(kě)在30分鍾內(nèi)完成。

③ 結果穩定，産量高(gāo)，OD260/OD280典型的比值達1.7～1.9，長度可(kě)達50 kb -150kb，可(kě)直接用于構建文庫，PCR，Southern-blot和(hé)各種酶切反應。

6/注意事項

① 所有(yǒu)的離心步驟均在室溫完成，使用轉速可(kě)以達到13,000 rpm的傳統台式離心機。

② 用戶需自備異丙醇、70％乙醇、0.5M EDTA和(hé)Lysozyme（溶菌酶）(用于革蘭氏陽性菌)、lysostaphin(用于某些(xiē)難裂解的革蘭氏陽性菌)、水(shuǐ)浴箱。

③ 開(kāi)始實驗前将需要的水(shuǐ)浴先預熱好備用。

④ 本試劑盒為(wèi)溶液型，可(kě)以很(hěn)容易的按照比例擴大(dà)或者縮小(xiǎo)每次處理(lǐ)的細菌細胞量，請(qǐng)聯系我們索取其它處理(lǐ)量的操作(zuò)手冊。

7/操作(zuò)步驟：（實驗前請(qǐng)先閱讀注意事項）

1、收集1ml過夜培養細菌加入1.5ml離心管。

2、9,000rpm離心30秒(miǎo)，使細胞沉澱下來(lái)，棄上(shàng)清，渦旋或輕彈打散細胞沉澱。對革蘭氏陽性菌，接步驟3。對革蘭氏陰性菌，直接接步驟6。

3、加入480μl 50mM EDTA完全重懸細胞。

4、加入120μl溶菌酶 (20mg/ml in 10 mM Tris-HCl，pH 8.0)，混勻。

對于大(dà)部分的革蘭氏陽性菌如Bacillus subtilis，Micrococcus luteus，Arthrobacter luteus，Nocardia otitidiscaviarum，Rhodococcus rhodochrous和(hé)Brevibacterium albidium，使用溶菌酶就可(kě)以有(yǒu)效裂解。但(dàn)是對于某些(xiē)種類的Staphylococcus，則應該加入60μl溶菌酶(20mg/ml)和(hé)60μl lysostaphin (20mg/ml)确保有(yǒu)效裂解。

5、37℃溫育30-60分鍾。12,000rpm離心2分鍾，棄上(shàng)清，渦旋或輕彈打散細胞沉澱。

6、加入600μl細胞核裂解液NLS至打散的細胞，輕柔吹打裂解細胞。

7、80℃溫育5分鍾裂解細胞，然後冷卻至室溫。

8、加入1.8μl RNase A（10mg/ml）至裂解物中至終濃度30μg/ml。颠倒混勻後37℃溫育15-60分鍾去除殘留RNA。然後室溫冷卻至少(shǎo)5分鍾使回複到室溫。

9、在回複到室溫的裂解物內(nèi)加入200μl蛋白沉澱液PPS後，在渦旋振蕩器(qì)上(shàng)高(gāo)速連續振蕩混勻25秒(miǎo)。混勻後可(kě)能見到一些(xiē)小(xiǎo)的蛋白團塊。冰浴5分鍾。

由于樣品體(tǐ)積重量小(xiǎo)，用渦旋振蕩器(qì)振蕩混勻産生(shēng)的剪切力并不會(huì)剪切打斷基因組DNA。如果用手振蕩混勻，則不可(kě)以用手上(shàng)下劇(jù)烈振蕩混勻，隻能适當力度振蕩混勻，否則會(huì)剪斷基因組DNA；但(dàn)是力度也不能小(xiǎo)，要保證充分混勻，将粘稠的裂解物打散開(kāi)，否則DNA無法和(hé)蛋白質沉澱分離開(kāi)，離心的時(shí)候會(huì)和(hé)蛋白質一起沉澱下來(lái)，造成DNA丢失或者降低(dī)産量。此外混勻不充分也可(kě)能造成蛋白沉澱不充分， 最後的産物污染有(yǒu)較大(dà)量的蛋白質。因此建議用渦旋振蕩器(qì)。

10、13,000rpm離心5分鍾。這時(shí)候應該可(kě)以見到管底白色的蛋白沉澱，也可(kě)能見到一些(xiē)蛋白沉澱漂浮在液體(tǐ)表面。

11、小(xiǎo)心吸取上(shàng)清到一個(gè)新的1.5ml離心管中。

吸取上(shàng)清時(shí)小(xiǎo)心不要吸到管底的和(hé)漂浮在液體(tǐ)表面的蛋白沉澱，如果不小(xiǎo)心将蛋白沉澱轉入新的離心管中，可(kě)再次離心2分鍾後取上(shàng)清。

12、加入等體(tǐ)積的室溫異丙醇（約600μl），輕柔颠倒30次混勻或者直到出現棉絮狀（絲狀）白色DNA沉澱。

注意有(yǒu)時(shí)候棉絮狀（絲狀）DNA颠倒混勻的時(shí)候，粘附着在蓋子或者管口處，即使颠倒也不跟下來(lái)，這樣導緻操作(zuò)者看不到沉澱，誤認為(wèi)沒有(yǒu)得(de)到DNA。解決辦法是略去步驟13，直接12,000rpm離心1分鍾，棄上(shàng)清，然後接步驟15。

13、垂直放置離心管，讓白色DNA沉澱自然沉到管底，然後盡可(kě)能多(duō)的吸棄大(dà)部分的上(shàng)清，注意不要吸到沉澱。

14、加入1ml70％乙醇後，颠倒漂洗DNA沉澱，12,000rpm離心1分鍾，在管底可(kě)以見到白色的DNA沉澱塊，倒棄上(shàng)清。

15、加入0.5ml70％乙醇，颠倒幾次漂洗DNA沉澱，12,000rpm離心1分鍾， 倒去上(shàng)清（注意不要把DNA沉澱倒掉了），倒置後在吸水(shuǐ)紙上(shàng)輕敲幾下以控幹殘留乙醇，還(hái)可(kě)以用槍頭小(xiǎo)心吸掉管底沉澱周圍和(hé)管壁的殘留乙醇，空(kōng)氣晾幹沉澱幾分鍾。

注意不要幹燥過頭，否則DNA極其難溶；也不能殘留太多(duō)乙醇，否則乙醇可(kě)能抑制(zhì)下遊如酶切反應。

16、加入100μlDNA溶解液DS重新水(shuǐ)化溶解DNA沉澱，輕彈管壁混勻，可(kě)以放置在65℃溫育30-60分鍾（不要超過一小(xiǎo)時(shí)），中間(jiān)不時(shí)的輕彈管壁幫助重新水(shuǐ)化DNA。也可(kě)以在室溫或者4℃放置過夜來(lái)重新水(shuǐ)化DNA，中間(jiān)不時(shí)颠倒輕彈幫助溶解。

17、DNA可(kě)以存放在2-8℃，如果要長時(shí)間(jiān)存放，可(kě)以放置在－20℃。

8/問題與解決方法